Ein neuartiges Hybridprotein bestehend aus Superoxid

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 6892 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Es wurde ein neuartiges Hybridprotein hergestellt, das aus einem Superoxiddismutase-aktiven Cu(II)-Komplex (CuST) und Lysozym (CuST@Lysozym) besteht. Die Ergebnisse der spektroskopischen und elektrochemischen Analysen bestätigten, dass CuST an Lysozym bindet. Wir bestimmten die Kristallstruktur von CuST@Lysozym mit einer Auflösung von 0,92 Å und zeigten, dass die His15-Imidazolgruppe von Lysozym an das Cu(II)-Zentrum von CuST in äquatorialer Position bindet. Darüber hinaus wurde CuST durch die schwache axiale Koordination der Thr89-Hydroxylgruppe und die Wasserstoffbrücke zwischen der Guanidiniumgruppe des Arg14-Rests und der Hydroxylgruppe von CuST in seiner Position fixiert. Darüber hinaus verringerte die Kombination von CuST mit Lysozym die Superoxiddismutaseaktivität von CuST nicht. Basierend auf den spektralen, elektrochemischen, strukturellen Studien und quantenchemischen Berechnungen wird ein durch CuST@Lysozym katalysierter O2-Disproportionierungsmechanismus vorgeschlagen.

Aerobe Organismen produzieren durch aerobe Atmung die Energie, die sie für ihr Leben benötigen. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) wie Hydroxylradikale (·OH), Singulettsauerstoff (1O2), Wasserstoffperoxid (H2O2) und Superoxid (O2–) sind die unvermeidlichen Nebenprodukte dieses Prozesses. Diese ROS verursachen schwere oxidative Schäden an Biomolekülen wie Lipiden, Kohlenhydraten, Hormonen, Proteinen und Nukleinsäuren. Unter diesen ROS wird O2– durch Elektronentransportsysteme, phagozytische Prozesse, enzymatische Oxidation und sauerstofftragende Proteine wie Hämoglobin und Myoglobin1 produziert. Unter protonischen Bedingungen reagiert O2– mit Protonen (H+) und erzeugt andere ROS, wie z. B. ·OH und H2O22. Daher hat die Entfernung von O2– für aerobe Organismen Priorität. Um O2– zu entfernen und durch O2– verursachte oxidative Schäden zu vermeiden, verfügen aerobe Organismen über Metalloenzyme, die als Superoxiddismutasen (SODs) bekannt sind. SODs katalysieren die Disproportionierung von O2– zu H2O2 und O2, wie in Reaktion (1) gezeigt:

Da SODs eine entscheidende Rolle beim Schutz von Biomolekülen vor oxidativen Schäden spielen, hängt die Lebenserwartung von Organismen von einer effizienten SOD-Aktivität ab. Organismen mit höheren SOD-Aktivitäten haben niedrigere Sterblichkeitsraten und umgekehrt3. Metallionen liegen in den aktiven Zentren von SODs, die über die Reaktionen (2) und (3) die Disproportionierung von O2– zu H2O2 und O2 katalysieren:

Basierend auf den in den aktiven Zentren vorhandenen Metallionen werden SODs in vier Kategorien eingeteilt; SODs, die Ni, Fe, Mn, Cu und Zn enthalten, sind als NiSOD4,5,6,7,8, FeSOD9,10,11,12,13, MnSOD14,15,16,17,18,19 und CuZnSOD20 bekannt. 21,22 bzw. In dieser Studie haben wir uns auf das am weitesten verbreitete CuZnSOD konzentriert, das Cu(II)- und Zn(II)-Ionen in seinem aktiven Zentrum enthält. Während das Zn(II)-Ion die sekundäre Koordinationsstruktur um das aktive Zentrum fixiert23, katalysiert das Cu(II)-Ion die Disproportionierungsreaktion von O2–, wie in den folgenden Reaktionen (4) und (5) gezeigt:

Um natives CuZnSOD als O2-Entfernungsmittel zu verwenden, müssen Probleme wie hohe Kosten und Instabilität gelöst werden24. In diesem Zusammenhang wurden Cu(II)-Komplexe mit niedrigem Molekulargewicht als funktionelle SOD-Modelle beschrieben25,26. Unter diesen Cu(II)-Komplexen wurden diejenigen, die durch Salicylsäure als Ligand koordiniert werden, als funktionelle SOD-Modelle beschrieben26. Unsere Gruppe berichtete auch über Cu(II)-Komplexe, die aus Phenolat- und L-Aminosäureeinheiten bestehen27. Allerdings können diese Koordinationsverbindungen nach der Freisetzung von Cu(II)-Ionen aus ihren Liganden für Biomoleküle toxisch sein28. Um dieses Problem zu lösen, haben wir uns auf die starke Cu(II)-Ionen-Bindungsfähigkeit von Proteinen konzentriert29.

In dieser Studie untersuchten wir als ersten Ansatz die Bildung eines Hybridproteins bestehend aus Lysozym, das wir aufgrund seiner Stabilität und Kristallinität ausgewählt hatten, und einem funktionellen SOD-mimetischen Cu(II)-Komplex. Von diesem SOD-mimetischen Hybridprotein wurde erwartet, dass es die Biokompatibilität und Stabilität des funktionellen SOD-Modell-Cu(II)-Komplexes verbessert.

Wir untersuchten und bestätigten auch die Bildung von CuST-bindendem Hybrid-Lysozym (CuST@Lysozym) und klärten dessen spektroskopische und elektrochemische Eigenschaften auf. Darüber hinaus haben wir seine SOD-Aktivität bewertet und auf der Grundlage sowohl experimenteller als auch rechnerischer Studien einen O2-Disproportionierungsmechanismus vorgeschlagen.

Um das Hybridprotein zu bilden, konzentrierten wir uns auf die Imidazolgruppe von nur einem His (His15)-Rest im Lysozym als Bindungsstelle für den Cu(II)-Komplex. Das Vorhandensein einer Imidazolgruppe auf der Oberfläche von Lysozym unterstützt auch die Bildung einer Koordinationsbindung mit dem Metallion. Tatsächlich können Mn(I)30-, Ag(I)31-, Au(I)32- und Pt(II)33-Ionen an diese Lysozymstelle binden. Wenn die Imidazolgruppe von His15 als Bindungsstelle fungiert, können die Guanidiniumgruppen von Arg14 und die Hydroxylgruppe von Thr89 über Koordinationsbindungen und/oder Wasserstoffbrücken mit dem Cu(II)-Komplex interagieren.

In diesem Zusammenhang haben wir einen SOD-Funktionsmodell-Cu(II)-Komplex mit einem Threoninderivat (CuST) hergestellt, wie in Abb. 1a 34 gezeigt. Es wird erwartet, dass ein Wassermolekül an der äquatorialen Position des Cu(II)-Komplexes ausgetauscht wird mit dem Imidazol des His15-Rests, um das CuST-gebundene Hybridlysozym zu bilden. Die vorgeschlagene Struktur des Hybridlysozyms ist in Abb. 1b dargestellt. Basierend auf dieser Struktur wird erwartet, dass sich Wasserstoffbrückenbindungen zwischen der Hydroxylgruppe von CuST und der Guanidiniumgruppe der Arg14-Seitenkette bilden, wohingegen das Metallzentrum von CuST voraussichtlich durch die Hydroxylgruppe des Thr89-Rests koordiniert wird. Diese Wechselwirkungen zwischen CuST und den funktionellen Gruppen am Lysozym können die starre Fixierung von CuST fördern.

Schematische Strukturen von (a) CuST und (b) der geschätzten Struktur des CuST-bindenden Lysozyms.

In dieser Studie gingen wir davon aus, dass His15 an das Cu(II)-Zentrum von CuST bindet. Um das Koordinationsverhalten von Imidazol zu untersuchen, stellten wir einen Imidazol-gebundenen Cu(II)-Komplex, CuST-Imi, her, indem wir CuST mit einer äquivalenten Menge Imidazol umsetzten.

Grüne, dünne, plattenförmige, transparente CuST-Imi-Kristalle, die für die Röntgenkristallographie geeignet sind, wurden durch langsames Eindampfen der Reaktionsmischung bei Raumtemperatur (300 K) über 3–4 Tage erhalten.

Die kristallographischen Datenerfassungs- und Verfeinerungsstatistiken für CuST-Imi sind in Tabelle S1 zusammengefasst. Einkristall-Röntgenbeugung ergab, dass CuST-Imi in der orthorhombischen Raumgruppe P212121 mit Z = 4 kristallisiert. Wie in Abb. 2 gezeigt, zeigte CuST-Imi eine verzerrte quadratisch-planare Geometrie. Darüber hinaus war das Cu(II)-Zentrum an das Phenolato-O-Atom, das Imino-N-Atom und eines der Carboxylat-O-Atome gebunden, um eine dreizähnige Struktur zu bilden; Ein zusätzlicher Imidazolligand wurde an die verbleibende äquatoriale Stelle des Cu(II)-Zentrums gebunden. Die Hydroxylgruppe des Thr-Rests des Liganden koordinierte nicht mit dem Cu(II)-Zentrum und war zur Außenseite des Kerns ausgerichtet. Der Abstand zwischen dem Cu(II)-Zentrum und dem Phenolato-O-Atom (1,891 Å) war etwas kürzer als die anderen Cu-N- und Cu-O-Abstände (1,931–1,956 Å). Der kürzere Bindungsabstand weist darauf hin, dass das Cu(II)-Ion, das Phenolato-O-Atom und das Imino-N-Atom einen strukturell stabilen sechsgliedrigen Chelatring bilden. Basierend auf den Bindungswinkeln N2–Cu–N3 (171,46°) und O1–Cu–O2 (165,30°) war die Geometrie von Cu(II) in CuST-Imi leicht vom quadratisch-planaren verzerrt.

Kristallstruktur von CuST-Imi mit thermischen Ellipsoiden, die mit einer Wahrscheinlichkeit von 50 % gezeichnet wurden. Ausgewählte Bindungslängen (Å) und Winkel (°): Cu1–O1 = 1,891(2), Cu1–O2 = 1,937(2), Cu1–N2 = 1,956(2), Cu1–N3 = 1,931(2), O1– Cu1–N3 = 95,21(9), N3–Cu1–O2 = 83,22(9), O1–Cu1–N2 = 92,87(8), O2–Cu1–N2 = 89,65(9), O1–Cu1–O2 = 165,30( 8) und N2–Cu1–N3 = 171,46(9).

Die FT-IR-Spektren von CuST und CuST-Imi sind in Abbildung S1 dargestellt. Sowohl CuST als auch CuST-Imi zeigten eine C=N-Streckschwingung bei 1633 cm−1. Im Gegensatz dazu traten die asymmetrischen ν(COO–)- und ν(COO–)-symmetrischen Schwingungen der Carboxylgruppe im Bereich von 1542–1535 cm–1 bzw. 1383–1382 cm–1 auf. Basierend auf dem Unterschied zwischen den asymmetrischen und symmetrischen Schwingungen (≈ 200 cm−1) wurde geschlossen, dass die Carboxylgruppen von CuST und CuST-Imi in nichtidentierter Weise an die Cu(II)-Zentren binden35 und die FT-IR-Spektralmerkmale stimmen mit der kristallographischen Analyse überein.

Die UV-Vis-Spektren von CuST und CuST-Imi sind in Abb. 3 dargestellt. CuST erzeugte eine starke Bande bei 356 nm und eine schwache Bande bei 678 nm, wohingegen CuST-Imi Banden bei 357 nm bzw. 656 nm aufwies. Absorptionsbanden im UV-Bereich werden auf den Ladungstransfer vom Ligand zum Metall zurückgeführt. Andererseits sind die im Bereich niedrigerer Energie auftretenden Banden auf d-d-Übergänge zurückzuführen, was darauf hindeutet, dass diese Cu(II)-Komplexe eine komprimierte quadratisch-planare Geometrie aufweisen36, was mit der kristallographischen Analyse übereinstimmt. Beim Vergleich ihrer UV-Vis-Spektren ergibt die Koordination von Imidazol an das Cu(II)-Zentrum von CuST eine energiereichere d-d-Bande im sichtbaren Bereich (678–656 nm).

UV-Vis-Spektren von CuST (0,1 mM, fette Linie) und CuST-Imi (0,1 mM, gestrichelte Linie). Beide Spektren wurden in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gemessen. Einschub: erweiterte Spektren im Bereich von 500–800 nm (1,0 mM).

Die Modell-UV-Vis-Spektren zeigten den gleichen Trend, d. h. eine Blauverschiebung des Maximums (37 nm), begleitet von einem Anstieg der Intensität (d. h. 356 M–1 cm–1 für CuST gegenüber 512 M–1 cm– 1 für CuST-Imi; Abb. 4). Um die Art des d-d-Übergangs der Komplexe zu klären, wurde eine NTO-Analyse (Natural Transition Orbital) durchgeführt (Abb. 5). Die direkte Molekülorbitalanalyse war nicht aussagekräftig, da die Ziel-d-d-Übergänge (S0–S3 und S0–S4) für CuST 16- und 12-Elektronen-Anregungen zwischen den besetzten und unbesetzten Molekülorbitalen umfassen. In ähnlicher Weise wurde für CuST-Imi eine gemischte MO-Anregung beobachtet. Die NTO-Analyse liefert ein intuitiveres Bild der Orbitale (gemischt oder nicht), die an der Loch-Teilchen-Anregung beteiligt sind37. Diese Methode ist für hochkomplexe Anregungen in der MO-Analyse sehr nützlich. Die d–d-Bänder für CuST werden durch zwei Anregungen gebildet, S0–S3 (f = 0,002135761) und S0–S4 (f = 0,003199473), und die für CuST-Imi werden durch eine S0–S2-Anregung (f = 0,002798322) gebildet. . Die NTO-Analyse der Übergangsdichte für CuST zeigt, dass der intensivste Elektronentransfer der intramolekulare Ladungstransfer ist. Die Verteilung der „Teilchen“-Übergangsorbitale (besetzt) ist für beide untersuchten Anregungen identisch und verteilt sich über den Benzolring, Azomethin, Hydroxylgruppen, Carboxylgruppen und Kupfer-d-Orbitale, mit einem kleinen Beitrag des koordinierten Wassermoleküls. Das „Loch“-Übergangsorbital (virtuell) ist einem „Partikel“ sehr ähnlich, weist jedoch einen geringeren Beitrag des Benzolrings, einen stärkeren Einfluss des Wassermoleküls und nur die Beteiligung des Kupfer-dx2-y2-Orbitals auf. Die Struktur „Partikel“. „ und „Loch“-Übergangsorbitale für CuST-Imi sind denen von CuST sehr ähnlich. Der einzige Unterschied besteht im „Loch“-Orbital, wo der Beitrag des Imidazolmoleküls in CuST-Imi signifikanter ist als der des Wassermoleküls Zusammen mit einer Änderung der Geometrien von CuST und CuST-Imi ist dies die Erklärung für den beobachteten Anstieg der Intensität der d–d-Banden.

Berechnete UV-Vis-Spektren von CuST (durchgezogene Linie) und CuST-Imi (gestrichelte Linie). Alle Ergebnisse wurden unter Verwendung einer TD-DFT-Näherung auf dem B3LYP/6-311G(d,p)-Theorieniveau erhalten. Einschub: Vergrößerung der Spektren im Bereich von 480–650 nm.

Darstellung natürlicher Übergangsorbitale (NTO) der „Partikel“- und „Loch“-Paare für die d-d-Bänder von CuST und CuST-Imi. Die NTO-Paare besetzen mehr als 1,97 von jedem angeregten Zustand (Isodichtekontur 0,03).

Um die Bindungseigenschaften von CuST zu untersuchen, wurden die UV-Vis-Spektraleigenschaften von CuST bei Zugabe von Lysozym analysiert. Die Spektren sind in Abb. 6 (d–d-Bereich) und Abb. S2 (vollständiger Bereich) dargestellt. In Gegenwart von Lysozym verschob sich der d-d-Übergang von CuST von 678 auf 658 nm. Diese Blauverschiebung des d-d-Übergangs stimmt mit der durch Imidazol-Koordination an CuST erhaltenen Blauverschiebung (von 678 bis 656 nm) überein und legt nahe, dass die Imidazolgruppe des His15-Rests an das Cu(II)-Zentrum in äquatorialer Position bindet. Zusätzlich zur Blauverschiebung nahm die Intensität der d-d-Bande leicht zu, was darauf hindeutet, dass die Symmetrie um das Cu(II)-Zentrum in Gegenwart von Lysozym verringert war. Im Allgemeinen werden Imidazolgruppen unter sauren Bedingungen (pH < 6) zu Imidazoliumkationen protoniert. Allerdings werden sie unter stark basischen Bedingungen (pH > 14) deprotoniert und bilden ein Imidazolat-Anion. Wenn der pH-Wert der Lösung zwischen 6 und 14 liegt, wird die Imidazolgruppe weder protoniert noch deprotoniert. Daher kann Imidazol in einer Lösung mit einem pH-Wert von 7,0 im neutralen Zustand an das Cu(II)-Zentrum binden. Obwohl dieses UV-Vis-Spektralverhalten nicht ausreichend quantitativ war, um die Bindungskonstanten zu bestimmen, war die spektrale Änderung qualitativ gesättigt. Darüber hinaus wurde CuST-Imi durch die Reaktion von CuST mit 1 Äq. erhalten. von Imidazol in guter Ausbeute (77,8 %). Basierend auf diesen Ergebnissen gehen wir davon aus, dass CuST ausreichend gut an die Imidazolgruppe von His15 bindet.

UV-Vis-Spektren von CuST (0,9 mM) im d-d-Bereich unter verschiedenen Konzentrationen von Lysozym (0–1,8 mM) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0). R: Konzentrationsverhältnis von Lysozym vs. CuST (Clysozym/CCuST). Diese Spektren wurden alle 0,4 Schritte von R gemessen (R = 0, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6, 2,0).

Um das elektrochemische Verhalten von CuST-Imi und CuST@Lysozym zu verstehen, wurde Cyclovoltammetrie (CV) durchgeführt. Als Kontrolle wurde ein Cyclovoltammogramm von Lysozym gemessen, um Redoxsignale im Potentialfenster des Phosphatpuffers zu vermeiden. Die Voltammogramme von CuST-Imi und CuST@Lysozym sind in Abb. 7 dargestellt. Bei einer Sweep-Rate von 5 mV/s zeigte CuST-Imi oxidative (I1) und reduktive (I2) Peaks bei −0,10 und −0,51 V (vs . Ag/AgCl). Diese Voltammogramme wurden erhalten, indem man mit negativen Durchläufen ihrer Ruhepotentiale begann. Wenn andererseits im ersten Scan keine anodischen Wellen beobachtet wurden, wurden für den ersten Scan positive Sweeps verwendet. Daher wurde angenommen, dass die irreversiblen Redoxprozesse von CuST und CuST@Lysozym Cu(I)/Cu(II) sind. Eine schnellere Sweep-Rate führte zu einer größeren oxidativen und reduktiven Welle, was zu einer positiven/negativen Verschiebung der oxidativen/reduktiven Peaks führte. Im Gegensatz dazu zeigte CuST@Lysozym oxidative (I2) und reduktive (I2') Peaks bei −0,04 bzw. −0,72 V und einer Abtastrate von 5 mV/s. Im Gegensatz zu CuST-Imi zeigte CuST@Lysozym vage oxidative/reduktive Wellen, wenn die Sweep-Rate erhöht wurde. Die unterschiedlichen Voltammogrammformen und elektrochemischen Verhaltensweisen, die sich aus verschiedenen Sweep-Raten ergeben, deuten darauf hin, dass CuST Lysozym nahezu quantitativ bindet. Die vagen oxidativen/reduktiven Wellen von CuST@Lysozym, die bei einer schnelleren Durchlaufgeschwindigkeit erhalten werden, können durch einen langsamen Elektronentransfer aufgrund von zwei Phänomenen erklärt werden: (1) langsamere Diffusion in Lösung aufgrund der großen Molekülgröße von CuST@Lysozym; Wenn CuST an Lysozym bindet, nehmen die Molekülgröße und das Molekulargewicht im Vergleich zu denen von CuST deutlich zu und größere Moleküle diffundieren langsamer in Lösung38; und (2) sterische Hemmung des Elektronentransfers zwischen dem Cu(II)-Zentrum von CuST@Lysozym und der Elektrode, da erwartet wird, dass das Cu(II)-Zentrum von CuST@Lysozym aufgrund seiner großen Molekülgröße für die Elektrode weniger zugänglich ist . Diese beiden Gründe stehen im Einklang mit der Tatsache, dass CuST an Lysozym bindet und ein Lysozym-CuST-Komposit bildet. Obwohl diese elektrochemischen Ergebnisse nicht ausreichen, um den Schluss zu ziehen, dass CuST an Lysozym bindet, haben wir entschieden, dass sie ausreichen, um eine Bindung zu implizieren. Obwohl der langsame Elektronentransfer und die niedrigen Redoxpotentiale von CuST@Lysozym nicht für die SOD-Aktivität geeignet sind, wird geschätzt, dass CuST@Lysozym eine schwache SOD-Aktivität zeigt, da die O2–-Disproportionierung durch Lewis-säureähnliche Metallionen katalysiert wird.

Zyklische Voltammogramme von (a) CuST-Imi (1,0 mM) und (b) CuST@Lysozym (CuST 1,0 mM + Lysozym 2,0 mM) bei verschiedenen Sweep-Raten (5–200 mV/s). Alle Voltammogramme wurden in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gemessen. Als Arbeits-, Gegen- und Referenzelektroden wurden Glaskohlenstoff-, Pt-Draht- und Ag/AgCl-Elektroden verwendet.

Die Zirkulardichroismus-Spektroskopie (CD) ist eine effiziente Technik zur Analyse sowohl der Stereochemie als auch der Konformationsänderungen chiraler Biopolymere bei Wechselwirkung mit Cu(II)-Komplexen. Daher wurde CD-Spektroskopie verwendet, um die sekundären Strukturänderungen im Lysozym bei seiner Reaktion mit CuST zu überwachen.

Die CD-Spektren von Lysozym, CuST und ihren Mischungen in verschiedenen Verhältnissen sind in Abb. 8 dargestellt. Anfänglich enthielt das CD-Spektrum der Lysozymlösung eine stark negative Bande bei 218 nm und einen negativen Schulterpeak bei 232 nm. Die beobachteten charakteristischen Signale stimmen mit denen von Lysozymen39,40 und Proteinen mit α-Helix- und β-Strang-Strukturen überein. Im Gegensatz dazu zeigte CuST positive Signale bei 241 und 258 nm und negative Signale bei 278 und 360 nm. Diese Signale wurden den chiralen Kohlenstoffatomen der Threonineinheit von CuST41 zugeschrieben. Bei der Zugabe von Lysozym zur CuST-Lösung drehte sich die negative Bande bei 278 nm ins Positive. Darüber hinaus ist das CD-Spektrum keine einfache Summe des Spektrums von CuST und Lysozym. Die CD-Spektren deuteten auf die Existenz von Wechselwirkungen zwischen CuST und Lysozym hin. Die spektralen Eigenschaften könnten jedoch auch darauf hindeuten, dass die Sekundärstruktur von Lysozym in Gegenwart von CuST denaturiert wird. Um die strukturellen Veränderungen von Lysozym in Gegenwart von CuST zu untersuchen, führten wir Messungen der Röntgenkleinwinkelstreuung (SAXS) durch.

CD-Spektren von CuST (1,0 × 10−1 mM), Lysozym (0,9 × 10−1 mM) und deren Mischung in verschiedenen Verhältnissen (R = CLysozym/CCuST). Diese CD-Spektren wurden in Phosphatpuffer (pH 7,0) mit steigender Lysozymkonzentration (0–0,9 × 10–1 mM) gemessen. Für die Messungen wurde eine Quarzküvette (Schichtdicke: 1,0 cm) verwendet.

Röntgenkleinwinkelstreuung (SAXS) wird häufig verwendet, um Veränderungen in der hierarchischen Struktur von Proteinen zu beobachten. Im Fall des in dieser Studie verwendeten Lysozyms sind die Streukurven in vier q-Wertbereiche unterteilt, nämlich weniger als 0,2 Å–1, ≈ 0,25–0,5 Å–1, ≈ 0,5–0,8 Å–1, und ≈ 1,1–1,9 Å–1, entsprechend (A) der Tertiärstruktur, (B) der Interdomänenkorrelation und den Intradomänenstrukturen, (C) den Sekundärstrukturen und (D) den dicht gepackten Seitenketten in den hydrophoben Kernen42 .

Wir haben Lösungen mit 3,75, 7,50 und 15,0 mg/ml Lysozym in Phosphatpuffer (pH 7,0) und in Acetatpuffer (pH 4,0) hergestellt. Diesen Lösungen wurde eine zehnfache Konzentration CuST zugesetzt, um ihre Röntgenstreukurven zu erhalten. Wie in Abb. S3 gezeigt, änderten sich die Röntgenstreukurven in beiden Pufferlösungen in Gegenwart von CuST nicht, was darauf hindeutet, dass in Gegenwart von CuST in der wässrigen Lösung keine Konformationsdenaturierung von Lysozym auftrat.

Ein für die kristallographische Analyse geeigneter Einkristall aus CuST@Lysozym wurde durch Einweichen von Einkristallen aus Lysozym erhalten, die mithilfe der Dampfdiffusionsmethode mit hängendem Tropfen hergestellt wurden. Die Gesamtstruktur und die kristallographischen Daten von CuST@Lysozym sind in Abb. S4 bzw. Tabelle S2 dargestellt. Die resultierende Elektronendichtekarte zeigt, dass CuST auf der Oberfläche von Lysozym aufgenommen wurde, um ein 1:1-Komposit mit einer CuST-Belegung von 0,7 zu bilden. Die Imidazolgruppe von His15 an der äquatorialen Position von CuST koordinierte mit dem zentralen Cu(II)-Ion und bildete eine quadratische planare Struktur.

Die detaillierte Struktur um das Cu(II)-Zentrum von CuST@Lysozym ist in Abb. 9 dargestellt. Zusätzlich zur Koordination des His15-Restes an das Cu(II)-Zentrum von CuST war die Seitenkette von Thr89 zum Cu hin ausgerichtet (II)-Zentrum, das in axialer Position eine schwache Bindung bildet (der Abstand zwischen Thr86-OH und Cu betrug 2,49 Å). Darüber hinaus ergab ein Vergleich der Strukturen, dass sich die Seitenkette von Arg14 bei der Koordination des His15-Restes von ihrer ursprünglichen Position zum Cu(II)-Zentrum bewegte und zwei Konformere mit 0,4- und 0,6-Besetzungen aufwies. Eine der fehlgeordneten Arg14-Seitenketten bildete Wasserstoffbrücken mit der Hydroxygruppe von CuST (2,48 und 2,69 Å). Diese Strukturmerkmale legen nahe, dass die CuST-Einheit von CuST@Lysozym zusätzlich zur Koordination des His15-Rests an das Cu(II)-Zentrum von CuST auch durch mehrere Wechselwirkungen fixiert ist, darunter schwache Koordination und Wasserstoffbrückenbindungen.

(a) Draufsicht und (b) Seitenansicht der Kristallstrukturen von CuST@Lysozym um das Cu(II)-Zentrum. Die 2Fo − Fc-Elektronendichtekarte hat eine Kontur von 1,0 σ. Rwork/Rfree = 0,1120/0,1291. Ausgewählte Bindungslängen (Å) und Winkel (°): Cu1–O1 = 1,994, Cu1–O2 = 2,035, Cu1–N2 = 1,979, Cu1–N3 = 1,983, O1–Cu1–N3 = 91,87, N3–Cu1–O2 = 82,62, O1–Cu1–N2 = 94,54, O2–Cu1–N2 = 90,91, O1–Cu1–O2 = 172,48 und N2–Cu1–N3 = 173,56.

Über die Bindungsfähigkeit von His15 an Metallionen wurde in einigen Studien berichtet, die sich mit Verbundwerkstoffen aus Lysozym und Metallionen wie Mn(I)30, Ag(I)31, Au(I)32, Pt(II)33 befassten und Rh(III)43. Das Mn(I)-Lysozym-Komposit entstand durch die Reaktion von Lysozym mit [Mn(CO)3(H2O)3]+, wobei das Metallzentrum durch drei Kohlenmonoxidmoleküle gebunden war (≈ 1,9 Å). Darüber hinaus interagierten die Imidazolgruppe von His15 (≈ 2,4 Å) und zwei Wassermoleküle (≈ 2,3 Å) schwach und bildeten eine verzerrte oktaedrische Struktur30. Im Ag(I)-Lysozym-Komposit wird das zentrale Ag(I)-Ion durch die Imidazolgruppe von His15 (≈ 2,1 Å), die Seitenkette von Arg14 und Asp87 (≈ 2,5 bzw. ≈ 2,3 Å) und Nitrat koordiniert Anion (≈ 2,0 Å) unter Bildung einer verzerrten dreieckigen Pyramidenstruktur31. Das Au(I)-Lysozym-Komposit wurde durch die Reaktion des Au(III)-Komplexes mit einem organischen Liganden und Lysozym32 hergestellt. Das Au(III)-Ion wird reduziert und verliert den organischen Liganden durch Hydrolyse bei der Bildung des Verbundwerkstoffs. Das Au(I)-Ion im Au(I)-Lysozym-Komposit ist an die Imidazolgruppe von His15 und die Seitenkette von Asn93 gebunden und bildet eine lineare Struktur32. Pt(II)-Komplexe wie Cisplatin ([PtCl2(NH3)2]) reagieren auch mit Lysozym zu Pt-Lysozym-Kompositen33. Die Imidazolgruppe von His15 (2,11 Å), das Amidato-Sauerstoffatom der Hauptkette (2,03 Å) und zwei Ammoniakmoleküle (2,03 Å) koordinieren an das Pt(II)-Ion und bilden eine verzerrte trigonale Pyramidenstruktur33. Zwei Chloridanionen dissoziieren bei der Bildung des Pt(II)-Lysozym-Komposits33. Rh(III)-Lysozym-Komposite wurden durch die Reaktion zwischen RhCl3 und Lysozym43 erhalten. Seitenketten von His15 (2,48 Å) und Arg14 (2,29 Å) binden an das Rh(III)-Zentrum und bilden eine gebogene Struktur43. Andere Plätze der Rh(III)-Ionen bleiben unbesetzt 43.

Obwohl die Metallzentren dieser Metall-Lysozym-Komposite durch Seitenketten wie His15 koordiniert sind, sind die anderen Stellen der Metallionen durch anorganische einzähnige Liganden besetzt oder bleiben unbesetzt. Darüber hinaus dissoziieren organische mehrzähnige Liganden in vielen Fällen durch Hydrolyse bei der Bildung von Metall-Lysozym-Kompositen. Es ist bemerkenswert, dass CuST@Lysozym ohne Dissoziation des organischen mehrzähnigen Liganden von CuST gebildet wurde.

Die Kristallstrukturen rund um die Cu(II)-Zentren von CuST-Imi und CuST@lysozym wurden verglichen. Beide Cu(II)-Ionen wurden durch Phenolatosauerstoff (O1), Carboxylatosauerstoff (O2), Imidazolstickstoff (N2) und Iminostickstoff (N3) koordiniert. Die Cu-O1- und Cu-O2-Abstände von CuST@-Lysozym (1,994 bzw. 2,035 Å) waren länger als die von CuST (1,891 bzw. 1,936 Å), wohingegen die Cu-N2- und Cu-N3-Bindungslängen von CuST@ Lysozym (1,979 bzw. 1,983 Å) waren etwas länger als die von CuST (1,956 bzw. 1,931 Å). Im Gegensatz dazu besaß CuST@Lysozym größere N2-Cu-N3- und O1-Cu-O2-Bindungswinkel (173,56° bzw. 172,48°) als CuST-Imi (171,46° bzw. 165,30°) und bildete quadratische, planare (oder quadratische). Pyramidenstrukturen mit geringerer Verzerrung als in CuST-Imi. Diese längeren Bindungslängen und kleineren Verzerrungen um das Cu(II)-Zentrum von CuST@Lysozym sind auf die schwache Koordination der Hydroxygruppe der Thr86-Seitenkette sowie auf die sterische Abstoßung zwischen der CuST-Einheit und dem Lysozym zurückzuführen. Basierend auf den oben genannten elektrochemischen Ergebnissen (Abb. 7) und spektroskopischen/kristallographischen Messungen konnten wir mit Sicherheit feststellen, dass CuST an Lysozym bindet.

Die Kristallstruktur von CuST@Lysozym enthält eine zu Arg14 gehörende Guanidiniumgruppe in der Nähe der CuST-Einheit, die Wasserstoffbrücken mit der Hydroxygruppe der Thr-Einheit des Liganden bildet. Andererseits verfügt SOD1 über dem aktiven Zentrum auch über eine zu Arg143 gehörende Guanidiniumgruppe, die O2–-Ionen elektrostatisch zum Metallzentrum zieht44. Daher ist zu erwarten, dass CuST@Lysozym aufgrund dieser elektrostatischen Wechselwirkung eine höhere SOD-Aktivität aufweist als CuST-Imi. Die SOD-Aktivitäten von CuST-Imi und CuST@lysozym wurden durch Messung ihrer IC50-Werte bewertet. Zur Vorbereitung der Proben werden 2 Äq. Lysozym wurden Lösungen von CuST-Imi, CuST und CuCl2 zugesetzt. Den UV-Vis-Spektren (Abb. 6) und den elektrochemischen Eigenschaften (Abb. 7) nach zu urteilen, bildete sich unter diesen Bedingungen CuST@Lysozym. Die IC50-Werte für CuST-Imi, CuST und CuCl2 betrugen 131, 143 bzw. 292 μM. Die SOD-Aktivität war deutlich höher als die von Lysozym (> > 2000 μM). Sowohl CuST-Imi als auch CuST zeigten höhere SOD-Aktivitäten als CuCl2, was darauf hinweist, dass die SOD-Aktivität der CuST-Einheit erhalten blieb, selbst wenn CuST an Lysozym gebunden war. Diese Ergebnisse zeigten, dass Lysozym SOD-Aktivität erlangte, indem es mit CuST einen Verbund bildete. Leider verbesserte sich die SOD-Aktivität der CuST-Einheit durch die Bindung an Lysozym nicht. Dies liegt daran, dass die Hydroxylgruppe von CuST Wasserstoffbrücken mit der Guanidiniumgruppe von Arg14 bildet und so die positive Ladung neutralisiert. Infolgedessen können O2–-Ionen keine starken elektrostatischen Wechselwirkungen mit der Guanidiniumgruppe von Arg14 eingehen, obwohl Wasserstoffbrückenbindungen eine wichtige Rolle bei der Fixierung der CuST-Einheit an Lysozym spielen.

Die Auswertung der SOD-Aktivität ergab, dass sowohl CuST-Imi als auch CuST@lysozym höhere SOD-Aktivitäten aufwiesen als CuCl2. Diese höhere SOD-Aktivität veranlasste uns, uns auf den Disproportionierungsmechanismus von O2– zu konzentrieren. Das Azidion (N3–) wird aufgrund seiner Größe und Lewis-Basizität, die denen von O2– 45 ähneln, häufig als Modellanion und Inhibitor von O2– verwendet. Um strukturelle oder mechanistische Informationen über die Cu(II)-Zentren zu erhalten von CuST-Imi und CuST@lysozym bei der Disproportionierung von O2– wurden die Koordinationseigenschaften des N3–-Ions an die Cu(II)-Stellen untersucht. Um die Koordinationsnatur der Addukte von CuST-Imi und CuST@lysozym mit dem N3–-Ion zu klären, wurden quantenchemische Berechnungen durchgeführt. Die optimierten Strukturen der Cu(II)-Komplexe, die mithilfe quantenchemischer Berechnungen erhalten wurden, sind in Abb. 10 dargestellt. In beiden Fällen koordinieren die N3–-Ionen an der apikalen Position der quadratischen Ebene ihrer Cu(II)-Zentren, um ein Quadrat einzunehmen Pyramidengeometrie. Die gebildete Cu-N-Bindung beträgt für beide Cu(II)-Zentren 2,41 Å. Der Unterschied zwischen CuST-Imi und CuST@lysozym mit dem N3–-Ion liegt in der Art der Wasserstoffbindung zwischen dem Stickstoffatom des koordinierten N3–-Ions und dem Wasserstoffatom der Hydroxylgruppe. Das gleiche Stickstoffatom koordiniert mit dem Cu(II)-Zentrum und geht Wasserstoffbrücken mit dem CuST-Imi-Addukt ein. In CuST@Lysozym bildet ein Stickstoffatom eine Koordinationsbindung mit dem Cu(II)-Zentrum und ein anderes terminales Stickstoffatom bildet eine Wasserstoffbrücke mit der Hydroxylgruppe.

Optimierte Strukturen von (a) CuST-Imi und (b) CuST@Lysozym mit N3-Ion. Ausgewählte Bindungslängen (Å) und Winkel (°) werden angezeigt.

Das UV-Vis-Spektralverhalten von CuST-Imi und CuST@lysozym in Gegenwart von N3–-Ionen ist in Abb. 11 dargestellt. Mit der Zugabe von N3–-Ionen erhöhte sich das Absorptionsmaximum bei 657 nm für jede Verbindung, entsprechend ihrem d –d Übergänge. Diese Erhöhungen ihrer Absorptionsmaxima weisen darauf hin, dass die Koordination von N3–-Ionen an ihre Cu(II)-Zentren die Symmetrien in den Strukturen in der Nähe der zentralen Metallionen verringert. Die optischen Modellspektren für die Addukte von CuST, CuST-Imi und CuST@Lysozym mit N3–-Ionen sind in Abb. S5 dargestellt. Die simulierten Spektren zeigen eine zunehmende Intensität von d-d-Übergängen im Bereich von 400–600 nm bei der Koordination von N3–-Ionen an die Cu(II)-Komplexe. Nach axialer Koordination des N3–-Ions an die Cu(II)-Zentren ergab sich eine leicht verzerrte quadratisch-pyramidale Koordinationsgeometrie, die weniger symmetrisch war als die anfängliche quadratisch-planare Struktur der Cu(II)-Komplexe.

UV-Vis-Spektren von (a) CuST-Imi (1,0 mM) und (b) CuST@Lysozym (CuST 1,0 mM + Lysozym 2,0 mM) in Gegenwart von 0, 10, 50 und 100 Äq. von NaN3 in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0).

Aufgrund ihrer Empfindlichkeit gegenüber Strukturänderungen rund um die Cu(II)-Zentren wird die EPR-Spektroskopie häufig verwendet, um Strukturinformationen zu Cu(II)-Komplexen zu erhalten. Die EPR-Spektraländerungen in Gegenwart von N3–-Ionen in CuST-Imi und CuST@Lysozym sind in Abb. 12 dargestellt, Vergleiche der gemessenen und simulierten EPR-Spektren sind in Abb. S6 dargestellt und die Beziehungen zwischen ihren g// und |A//| Die Werte sind in Abb. 13 und Tabelle S3 zusammengefasst. In Abwesenheit des N3–-Ions wies CuST-Imi g//- und g⊥-Werte von 2,25 bzw. 2,07 auf, während die Werte für CuST@Lysozym 2,24 bzw. 2,06 betrugen. Beide EPR-Spektren zeigten größere g//-Werte als g⊥-Werte, was darauf hindeutet, dass sich ihre ungepaarten Elektronen in ihren dx2-y2-Orbitalen befanden, was darauf hindeutet, dass die Strukturen um das Cu(II)-Zentrum von CuST-Imi und CuST@lysozym quadratisch planar waren oder quadratisch-pyramidenförmig46. CuST@lysozym besaß kleinere g// und größere |A//| Werte als CuST-Imi (Abb. 13, Tabelle S3). Im Allgemeinen weisen Cu(II)-Komplexe mit verzerrten quadratisch-planaren Strukturen größere g// und kleinere |A//| auf Werte als die von unverzerrten quadratisch-planaren Strukturen 47. Basierend auf diesen Tendenzen sind das kleinere g// und das größere |A//| Die Werte von CuST@Lysozym im Vergleich zu denen von CuST-Imi stimmen mit ihren Kristallstrukturen überein, insbesondere mit der geringeren Verzerrung im Vergleich zu denen von CuST-Imi.

EPR-Spektren von (a) CuST-Imi und (b) CuST@Lysozym in Gegenwart von NaN3. Die fetten, gestrichelten und gepunkteten Linien stellen die Spektren dar, die in Abwesenheit von NaN3 in Gegenwart von 50 Äq. erhalten wurden. NaN3 und in Gegenwart von 100 Äq. von NaN3 bzw. Alle Proben wurden als 1 mM Lösungen von 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) mit 10 % Ethylenglykol hergestellt, gemessen bei – 196 °C.

Änderungen in g// und |A//| Werte von CuST (roter Kreis), CuST-Imi (orange Kreise) und CuST@lysozym (blaue Kreise) nach Zugabe von 0, 50 und 100 Äq. von NaN3. Die ausgefüllten und leeren Kreise bezeichnen die experimentell bzw. theoretisch ermittelten Werte.

In Gegenwart von N3–-Ionen sind die g// und |A//| Die Werte von CuST-Imi und CuST@Lysozym verschoben sich allmählich, und beide Verbindungen zeigten größere g// und kleinere |A//| Werte. Diese Verschiebungen sind typisch für die Strukturänderung von quadratisch-planar zu quadratisch-pyramidal bei axialer Koordination zu Cu(II)-Komplexen mit quadratisch-planaren Strukturen47. Daher deuten diese EPR-Spektraländerungen darauf hin, dass N3–-Ionen axial an das Cu(II)-Zentrum von CuST-Imi und CuST@Lysozym koordiniert waren. Diese EPR-spektroskopischen Verhaltensweisen stimmen mit der kristallographischen Analyse überein, da CuST@Lysozym über ausreichend Platz verfügt, um das N3–-Ion am Cu(II)-Zentrum zu binden.

Die theoretisch erhaltenen g// und |A//| Die Werte von CuST-Imi und CuST@lysozym und ihren N3–-Addukten wurden durch DFT-Näherung berechnet und sind in Abb. 13 und Tabelle S4 zusammengefasst. In dieser Berechnung sind g// und |A//| Die Werte wurden als Durchschnittswerte von gx, gy und |Az| ausgewertet Werte. Im CuST ist das |A//| Die Werte nehmen leicht ab, da die Koordinationsumgebung des Cu(II)-Ions nicht wesentlich verändert wird, da bei dieser Reaktion axial koordinierte Methanolmoleküle durch das N3-Anion abgeschieden werden. Wie in Abb. 10 gezeigt, änderten sich die Koordinationsgeometrien von CuST-Imi und CuST@Lysozym bei axialer Koordination des N3–-Ions von quadratisch-planar zu quadratisch-pyramidal. Die strukturellen Veränderungen spiegeln sich in g// und |A//| wider Werte wie folgt: Die DFT-Modellierung ergab, dass CuST-Imi und CuST@lysozym bei der Koordination des N3–-Ions größere g//-Werte zeigten, während ihre |A//| Die Werte 30 (für CuST-Imi) und 37 MHz (für CuST@Lysozym) verringerten sich bei N3-Koordination. Diese theoretischen Ergebnisse stimmen mit den experimentell erhaltenen g// und |A//| überein Werte bei N3–-Bindung.

Basierend auf diesen Erkenntnissen wurden O2–-Ionen axial an das Cu(II)-Ion von CuST@Lysozym gebunden.

Quantenchemische Berechnungen wurden durchgeführt, um den durch CuST@Lysozym katalysierten O2-Disproportionierungsmechanismus abzuschätzen. Als Modellverbindung von CuST@Lysozym wurde eine vereinfachte Modellverbindung, koordiniert durch einen zusätzlichen Liganden mit einem Arg-His-Gerüst (CuST-Arg-His), verwendet, um Rechenressourcen zu sparen. Bei der Abschätzung des O2-Disproportionierungsmechanismus gingen wir von fünf Zuständen und fünf Schritten aus, wie in Abb. 14 dargestellt. Es wurden fünf Zustände angenommen: (A) Cu(II)-Ruhezustand, (B) O2-bindender Cu(II)-Zustand , (C) Cu(I)-Ruhezustand, (D) O2-wechselwirkender Cu(I)-Zustand und (E) H2O2-wechselwirkender Cu(II)-Zustand. Die folgenden Schritte wurden ebenfalls angenommen: (1) Cu(II)-O2-Speziesbildungsschritt, (2) O2-Oxidationsschritt, (3) O2-wechselwirkende Cu(I)-Speziesbildungsschritt, (4) H2O2-wechselwirkender Cu(II)-Speziesbildungsschritt und (5) H2O2-Abgangsschritt.

Theoretisch vorgeschlagener O2-Disproportionierungsmechanismus. Es wurde eine vereinfachte Modellverbindung verwendet, die durch einen zusätzlichen Liganden mit einem Arg-His-Gerüst (CuST-Arg-His) koordiniert wurde.

Im Cu(II)-Ruhezustand befindet sich CuST-Arg-His im Dublettzustand, da das Cu(II)-Zentrum ein ungepaartes Elektron aufweist und die berechnete Struktur von CuST-Imi eine leicht quadratische planare Geometrie zeigt. Diese Ergebnisse stimmten mit der kristallographischen Analyse und den EPR-spektroskopischen Eigenschaften von CuST-Imi überein.

Im Cu(II)-Ruhezustand binden O2–-Ionen an Cu(II)-Ionen und bilden O2–-bindende Cu(II)-Spezies. Aufgrund der ungepaarten Elektronen von Cu(II)- und O2–-Ionen können Singulett- oder Triplettzustände gebildet werden. Basierend auf einem Vergleich ihrer Stabilitäten ergibt der Triplett-Zustand eine um 20,39 kcal/mol niedrigere Energie als der Singulett-Zustand (Abb. S7). In diesem Zustand binden O2–-Ionen an Cu(II)-Ionen und bilden eine verzerrte quadratisch-pyramidale Struktur. Das Cu(II)-bindende O2–-Ion bildete eine Wasserstoffbrücke mit der Hydroxylgruppe des Liganden. Erwähnenswert ist, dass die Koordinations- und Wasserstoffbrückenbindungen vom selben Sauerstoffatom gebildet werden. Eine ähnliche Wasserstoffbindung wird von der optimierten Struktur des N3-bindenden CuST-Imi erwartet, wie in Abb. 10 erwähnt.

Unter protischen Bedingungen interagiert H+ mit dem Carboxylat der O2-bindenden Cu(II)-Spezies und bildet den Cu(I)-Ruhezustand. In diesem Schritt wurde das gebundene O2–-Ion durch das Cu(II)-Ion zu O2 oxidiert. In diesem Zustand wurde das Carboxylat des Liganden protoniert, wobei das Cu(I)-Ion zurückblieb.

Zusätzliche O2–-Ionen binden an die ruhenden Cu(I)-Spezies und bilden mit O2–wechselwirkende Cu(I)-Spezies. In diesem Zustand koordiniert das O2–-Anion nicht an das Cu(I)-Ion, sondern wird durch die Wasserstoffbrückenbindungen fixiert, die zwischen der Carboxylgruppe und dem Guanidinium der Arg-Seitenkette gebildet werden.

In den mit O2–wechselwirkenden Cu(I)-Spezies reagieren H+-Ionen mit dem O2–-Anion unter Bildung von mit H2O2 wechselwirkenden Cu(II)-Spezies. In diesem Zustand bindet das H2O2-Molekül auch nicht an das Cu(II)-Ion, sondern ist durch vier Wasserstoffbrückenbindungen mit den Carboxylat- und Guanidiniumgruppen fixiert. Der nicht O2-koordinierende O2-Reduktionsmechanismus wurde auch für natives CuZnSOD23 vorgeschlagen.

Im letzten Schritt interagiert das H2O2-Molekül mit dem Cu(II)-Ion, um den Cu(II)-Ruhezustand wiederherzustellen.

Ein neuartiges Hybridprotein bestehend aus einem SOD-aktiven Cu(II)-Komplex und Lysozym (CuST@Lysozym) wurde hergestellt und seine spektroskopischen und elektrochemischen Eigenschaften untersucht. Der kristallographischen Analyse zufolge wird CuST durch eine äquatoriarisch koordinierte Imidazolgruppe der His15-Seitenkette, eine axial koordinierte Hydroxylgruppe von Thr89 und eine Wasserstoffbrücke zwischen der Hydroxylgruppe von CuST und der Guanidiniumgruppe von Arg14 am Lysozym fixiert Rückstand (Abb. 9). Sowohl CuST-Imi als auch CuST@lysozym zeigten höhere SOD-Aktivitäten als CuCl2 und Lysozym. Basierend auf den SOD-Aktivitätsbewertungen erlangte Lysozym SOD-Aktivität durch die Bildung eines Verbundstoffs mit CuST. Die UV-Vis- und EPR-Spektren zeigten, dass das N3–-Ion an das Cu(II)-Zentrum von CuST@Lysozym koordiniert war (Abb. 11 und 12), was darauf hindeutet, dass das O2–-Ion auch an das Cu(II)-Zentrum koordinieren kann . Basierend auf spektroskopischen und quantenchemischen Simulationen wurde ein O2-Disproportionierungsmechanismus vorgeschlagen. Unsere Studie liefert wertvolle Erkenntnisse für das rationale Design neuer SOD-Therapeutikakandidaten, die Nebenreaktionen aufgrund der Zersetzung des SOD-Mimetikumkomplexes vermeiden. Um die Stabilität des Hybridproteins in biologischen Flüssigkeiten wie Plasma und Zytosol zu verbessern, wurden die folgenden drei Strategien verfolgt. (1) Um die Ligandendissoziation zu unterdrücken, wurden Komplexe später Übergangsmetalle als Bindungsverbindungen für Lysozym verwendet. (2) Um die Wechselwirkung zwischen den Komplexen und Lysozym zu erhöhen, wurden Liganden mit wasserstoffbrückenbindenden Einheiten verwendet. (3) Da Lysozym viele basische Seitenketten enthält, verbesserte die Einführung saurer funktioneller Gruppen in die Liganden die Stabilität der Metall-Lysozym-Komposite. Durch die Verbesserung der Stabilität der Metall-Lysozym-Komposite mithilfe dieser Methoden werden tiefergehende Diskussionen über ihre therapeutischen Anwendungen erwartet.

Chemische Reagenzien wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation (Osaka, Japan), Tokyo Chemical Industry Co. Ltd. (Tokio, Japan) und Kanto Chemical Co. Inc. ( Tokyo, Japan). Alle Reagenzien waren von höchster kommerzieller Qualität und wurden ohne weitere Reinigung verwendet.

Elementaranalysen (C, H und N) wurden mit einem Perkin-Elmer 2400 II CHNS/O-Analysator an der Tokyo University of Science durchgeführt. IR-Spektren wurden mit einem JASCO FT-IR 4200-Spektrophotometer (JASCO, Tokio, Japan) im Bereich von 4000–400 cm−1 bei 298 K aufgezeichnet. UV-Vis-Spektren wurden mit einem JASCO V-570-Spektrophotometer im Bereich von gemessen 800 − 250 nm bei Raumtemperatur. Die Lösungskonzentrationen lagen im Bereich von 0,1 bis 1,0 mM und zur Aufnahme der Proben wurden Quarzzellen (Pfadlänge: 1,0 cm) verwendet. Die CD-Spektren wurden mit einem JASCO J-725-Instrument gemessen. Die Lösungskonzentrationen betrugen 0,1 mM (CuST) bzw. 0,09 mM (Lysozym). Für die Messungen wurden Quarzküvetten (Pfadlänge: 1,0 cm) verwendet. SAXS-Messungen wurden an der Strahllinie BL-10C der 12-keV-Synchrotronstrahlungsquelle in der Photon Factory der High Energy Accelerator Research Organization (KEK, Tsukuba, Japan) durchgeführt. Die Konzentrationen von Lysozym und CuST betrugen 0,25–1,0 mM bzw. 1,0 mM. EPR-Spektren der Komplexe wurden mit einem Bruker EMX-nano EPR-Spektrometer (X-Band) bei 77 K aufgezeichnet, wobei 1 mM Lösungen von CuST-Imi und CuST@Lysozym als Proben in Quarzröhrchen gemessen wurden. Die elektrochemischen Eigenschaften der synthetisierten Komplexe wurden mittels zyklischer Voltammetrie (ALS/DY2323 BI-POTENTIOSTAT) in einer 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gemessen. Als Arbeits-, Gegen- und Referenzelektroden wurden Glaskohlenstoff-, Pt-Draht- und Ag/AgCl-Elektroden verwendet. Die CV-Kurven von CuST-Imi (1,0 mM), CuST@Lysozym (CuST 1,0 mM) und Lysozym (2,0 mM) wurden über drei Zyklen unter einer Stickstoffatmosphäre bei Raumtemperatur mit einer Potentialdurchlaufrate von 5–200 mVs gemessen 1.

Der Cu(II)-Komplex CuST wurde mit einer veröffentlichten Methode34 synthetisiert.

L-Threonin (0,119 g, 1 mmol), Salicylaldehyd (0,122 g, 1 mmol) und KOH (0,056 g, 1 mmol) wurden in 15 ml Methanol gelöst und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde dieser Lösung eine Methanollösung (15 ml) von Kupfer(II)acetat-Monohydrat (0,182 g, 1 mmol) zugesetzt. Nach 15-minütigem Rühren wurde eine Methanollösung (5 ml) von Imidazol (0,068 g, 1 mmol) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3–4 Tage lang bei Raumtemperatur gehalten und ergab grüne, nadelförmige Einkristalle, die für röntgenkristallographische Messungen geeignet waren.

Ausbeute: 0,275 g (77,8 %). Elementare Analyse. Berechnet für C14H15N3O4Cu, C: 47,66 %, H: 4,29 %, N: 11,91 %, gefunden: C: 47,64 %, H: 3,94 %, N: 11,79 %.

Zunächst wurde ein Einkristall aus Hühnereiweiß-Lysozym (HEWL) mithilfe der Dampfdiffusionsmethode mit hängendem Tropfen hergestellt. Als Kristallisationslösung wurde 0,1 M Essigsäure-Natriumacetat-Puffer (pH 4,7) mit 2–6 % (Gew./Vol.) NaCl verwendet. Der Kristallisationslösung (5 µL) wurden fünf Mikroliter Lysozymlösung (50 mg/ml) zugesetzt, um Einkristalle aus Lysozym zu bilden. Die Kristalle wurden dann in einen Tropfen überführt, der eine Mischung aus 10 µL Kristallisationslösung und 5 µL CuST-gesättigter Lösung in MeOH enthielt; Dieser Tropfen wurde einige Minuten bei 4 °C inkubiert. Die Kristalle wurden über der ursprünglichen Kristallisationslösung gewaschen, um überschüssiges CuST von der Kristalloberfläche zu entfernen. Die Kristalle wurden einige Minuten lang in einer Kristallisationslösung mit 20 % Ethylenglykol eingeweicht und dann in flüssigem Stickstoff blitzgekühlt.

Die Röntgenintensitätsdaten der CuST-getränkten Kristalle wurden bei 100 K mit einem Eiger X16M (Dectris)-Detektor auf BL-17A in der Photon Factory der High Energy Accelerator Research Organization (KEK, Tsukuba, Japan) gesammelt. Die Wellenlänge der Synchrotronstrahlung, der Abstand zwischen Probe und Detektor, der Schwingungsbereich und die Belichtungszeit betrugen 0,98 Å, 95 mm, 0,5° (insgesamt 180°) bzw. 0,2 s. Die höchste Auflösung betrug 0,92 Å, verarbeitet mit XDS48. Die Kristalle gehörten zur tetragonalen Raumgruppe (P43212) und die Struktur wurde durch molekularen Ersatz mit MOLREP49 aus dem CCP4-Programmpaket50 unter Verwendung eines nativen HEWL-Modells gelöst, das zur gleichen Raumgruppe gehört (PDB-Code: 5LYT)51 wie das Suchmodell. Die Modellerstellung und -verfeinerung erfolgte mit der Software COOT52 bzw. PHENIX53. Die Statistiken zur Datenerfassung und -verfeinerung sind in Tabelle S2 zusammengefasst. Die Atomkoordinaten und Strukturfaktoren wurden im PDB unter dem Zugangscode 7YRK hinterlegt. Bilder der Kristallstrukturen wurden mit PyMOL54 erstellt.

Ein Einkristall aus CuST-Imi wurde auf die Glasfaser geklebt und mit einer dünnen Schicht Epoxidharz beschichtet, um die Beugungsdaten zu messen. Die Intensitätsdaten wurden mit einem Bruker APEX2 CCD-Diffraktometer mit graphitmonochromatisierter Mo-Kα-Strahlung (λ = 0,71073 Å) erfasst. Die Datenanalyse wurde mit dem SAINT-Softwarepaket durchgeführt. Die Strukturen wurden mit direkten Methoden unter Verwendung von SHELXS-97 gelöst, durch Fourier-Techniken erweitert und unter Verwendung von Vollmatrix-Methoden der kleinsten Quadrate basierend auf F2 (SHELXL-97)55 verfeinert. Mithilfe des SADABS-Programms wurde eine empirische Absorptionskorrektur angewendet. Alle Nichtwasserstoffatome konnten mithilfe anisotroper thermischer Parameter leicht lokalisiert und verfeinert werden. Alle Wasserstoffatome wurden an geometrisch berechneten Positionen lokalisiert und mithilfe von Reitmodellen verfeinert.

Die SOD-Aktivitäten der Cu(II)-Komplexe CuST-Imi und CuST@lysozyme wurden mit dem SOD-Assay-Kit-WST (Dojindo, Kumamoto, Japan), das auf der Xanthin-Xanthin-Oxidase-Methode basiert, gemäß den Anweisungen des Herstellers bewertet . Die Absorption wurde bei 450 nm in einer 96-Well-Platte unter Verwendung eines iMark Microplate Reader (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) gemessen.

Alle DFT-Berechnungen wurden mit dem Programm Gaussian 0956 durchgeführt. Für jede in dieser Arbeit vorgestellte Verbindung wurde eine vollständige geometrische Optimierung ausgehend von den verfügbaren kristallographischen Strukturen durchgeführt. Die Geometrien wurden mithilfe von B3LYP57-Funktionalen mit einem Split-Valence-Basissatz (6-311G(d,p))58,59 optimiert. Alle stationären Punkte (SP) wurden als Minima identifiziert (es wurden keine Normalschwingungen mit imaginären Frequenzen festgestellt) und Übergangszustände wurden als erste angeregte Zustände (eine imaginäre Frequenz) identifiziert. Alle offenschaligen Systeme wurden mit einem uneingeschränkten Formalismus ohne Symmetrieeinschränkungen behandelt. Um das Auftreten von Spinverunreinigungen in den U-DFT-Berechnungen zu beurteilen, wurde der für < S2 > erhaltene Wert mit dem erwarteten S(S + 1) für den Spinzustand (Dublettzustand) verglichen. In allen durchgeführten Berechnungen wurde festgestellt, dass die Spinverunreinigung weniger als 3 % beträgt und daher vernachlässigbar ist. Die Strukturen der Komplexe wurden mit der ChemCraft-Software Ver visualisiert. 1.660. Zur Modellierung der optischen Eigenschaften wurden die 120 niedrigsten Anregungszustände ausgewählt. Eine zunehmende Anzahl von Anregungen führte zu Banden im tiefen Ultraviolettbereich des Spektrums, der nicht der Zielbereich dieser Forschung war. Berechnungen wurden für die isolierten Moleküle und Moleküle im Lösungsmittelmedium (Wasser) durchgeführt. Für Letzteres wurde ein polarisierbares Kontinuumsmodell übernommen61. Das molare Absorptionsvermögen ε (L mol−1 cm−1) wurde mit dem Programmpaket GaussSum 3.062 berechnet. Der g-Tensor und die Hyperfeinkopplungskonstanten (A-Tensor) wurden mit dem ORCA 5-Programmpaket63 berechnet. Ein hybrides Becke-Drei-Parameter-Funktional (B3LYP) wurde in Kombination mit dem Pople-Basissatz (6-311G(d,p)) verwendet. Der A-Tensor wurde als Summe von drei Beiträgen erhalten: dem isotropen Fermi-Kontakt (AFC), dem anisotropen Dipol (\({\mathrm{A}}_{x, y, z}^{D}\)) und Spin-Bahn-Kopplungsterm \({(\mathrm{A}}_{x,y,z}^{SO})\). Diese Näherung reproduziert die Zielparameter64,65.

Die in diesem Artikel angegebenen kristallographischen Daten und Beugungsintensitäten (CIF) wurden beim Cambridge Crystallographic Data Centre (CCDC) unter der Referenznummer (2194652) hinterlegt. Die Atomkoordinaten und Strukturfaktoren für CuST@lysozym wurden in der Protein Data Bank (PDB) mit dem Zugangscode 7YRK hinterlegt. Alle Daten sind im Haupttext oder in Zusatzinformationen bzw. auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Wir danken Dr. Nobutaka Shimizu (KEK, Japan) für die SAXS-Messungen. Wir danken auch den Mitgliedern der PF-Beamline für ihre Hilfe bei der Erfassung der Röntgenintensitätsdaten. Die Projektnummern der Röntgenbeugungsexperimente am PF lauten 2019G512, 2020P003 und 2022G012. Diese Arbeit wurde teilweise durch einen Grant-in-Aid for Scientific Research (A) KAKENHI (20H00336) unterstützt. Quantenchemische Berechnungen wurden unter Verwendung der Ressourcen des Zentrums für gemeinsame Nutzung von SFedU, „The High-Performance Computing“ und GENCI (Frankreich), Projekt gen7041, durchgeführt. Diese Forschung (quantenchemische Simulationen) wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Hochschulbildung der Russischen Föderation Nr. 0852-2020-0019 (staatlicher Auftrag im Bereich der wissenschaftlichen Tätigkeit, Südliche Föderale Universität, Projekt Nr. BAZ0110/20- 2020) finanziell unterstützt. 1-03EH). Wir möchten Editage (www.editage.com) für die englischsprachige Bearbeitung danken.

Department of Chemistry, Faculty of Science, Tokyo University of Science, 1-3 Kagurazaka, Shinjuku-ku, Tokio, 162-8601, Japan

Tetsundo Furuya, Daisuke Nakane, Kenichi Kitanishi, Natsuki Katsuumi und Takashiro Akitsu

Jean Monnet Saint-Etienne University, CNRS, Institut d Optique Graduate School, Laboratoire Hubert Curien UMR 5516, 42023, Saint-Étienne, Frankreich

Arshak Tsaturyan

Institut für physikalische und organische Chemie, Southern Federal University, 194/2 Stachka Ave., Rostow am Don, 344090, Russland

Arshak Tsaturyan

Fakultät für Chemie, Southern Federal University, 7 Zorge Str., Rostow am Don, 344090, Russland

Igor N. Schtscherbakow

Graduate School of Science and Engineering, Ibaraki University, 4-12-1 Nakanarusawa, Hitachi, Ibaraki, 316-8511, Japan

Masaki Unno

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TA betreute diese Studie; TF und DN konzipierten die Experimente; MU und KK haben die Protein-Röntgenstruktur gemessen und analysiert; TF und NK führten weitere Experimente durch; und IS und AT führten die DFT-Berechnungen durch. DN, TF und AT haben das Manuskript geschrieben und TA hat das Manuskript überarbeitet.

Korrespondenz mit Daisuke Nakane oder Takashiro Akitsu.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Furuya, T., Nakane, D., Kitanishi, K. et al. Ein neuartiges Hybridprotein, bestehend aus Superoxid-Dismutase-aktivem Cu(II)-Komplex und Lysozym. Sci Rep 13, 6892 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33926-1

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Eingegangen: 15. September 2022

Angenommen: 20. April 2023

Veröffentlicht: 27. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33926-1

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