Charakterisierung und Anti | Guizhou Resin Group

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 14302 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Ein patentierter Stamm von Bacillus amyloliquefaciens C-1 in unserem Labor könnte unter optimierten Fermentationsbedingungen funktionelles Natriumselenit (Na2SeO3) produzieren. Aufgrund der starken Stressresistenz und der reichlich vorhandenen Sekundärmetaboliten zeigte C-1 Potenzial für die Entwicklung als mit Selen angereichertes Postbiotika. C-1 hat die Fähigkeit, SeNPs zu synthetisieren, wenn es mit 100 μg/ml Na2SeO3 für 30 Stunden bei 30 °C aerob mit 10 % Samenkultur inkubiert wird. Die Umwandlungsrate von Na2SeO3 in SeNPs erreichte 55,51 %. Nach der Selenanreicherung gab es keine signifikanten morphologischen Veränderungen in C-1-Zellen, aber offensichtlich sammelten sich SeNPs im Inneren der Zellen an, beobachtet durch Rasterelektronenmikroskop und Transmissionselektronenmikroskop, verifiziert durch energiedispersive Röntgenspektroskopie und Röntgenphotoelektronenspektroskopie. SeNPs hatten eine antioxidative Aktivität beim Radikalfänger von Superoxid (O2−), Hydroxylradikal (OH−) und 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazin (DPPH), wobei die Fähigkeit zum Radikalfänger von OH− am höchsten ist. Mit Selen angereichertes C-1 hatte eine offensichtliche entzündungshemmende Wirkung beim Schutz der Integrität der durch S. typhimurium zerstörten Caco-2-Zellmembran; Es könnte entzündliche Schäden in Caco-2 verhindern, das 4 Stunden lang durch 200 μM H2O2 belastet wird, mit deutlich reduzierter Expression von IL-8 (1,687 vs. 3,487, P = 0,01), IL-1β (1,031 vs. 5,000, P < 0,001). , TNF-α (2,677 vs. 9,331, P < 0,001), erhöhte Claudin-1 (0,971 vs. 0,611, P < 0,001) und Occludin (0,750 vs. 0,307, P < 0,001). Die Analyse der Transkriptomdaten zeigte, dass es im vegetativen Wachstumsstadium 381 Differenzierungsgene und im Sporulationsstadium 1674 Differenzierungsgene von C-1 mit und ohne Selenanreicherung gab. Insgesamt wurden 22 ABC-Transporterprotein-bezogene Gene im vegetativen Stadium und 70 ABC-Transporterprotein-bezogene Gene im Sporulationsstadium gefunden. Gene, die für die Reduktion von MsrA, Thiol, Glutathion und Thioredoxin kodieren, waren signifikant hochreguliert; Gene, die mit der ATP-Synthase in Zusammenhang stehen, wie die Gene atpA und atpD, zeigten im vegetativen Stadium eine Herunterregulierung; Die flagellenbezogenen Gene (flgG, fliM, fliL und fliJ) zeigten während der Sporulationsphase eine Herunterregulierung. Die Motilität, Chemotaxis und Kolonisierungsfähigkeit wurden geschwächt, zusammen mit der Anhäufung synthetisierter SeNPs intrazellulär im Sporulationsstadium. B. amyloliquefaciens C-1 könnte extrazelluläres Selenit über den Oxidations-Reduktions-Weg mit starkem Selen-angereichertem Stoffwechsel in intrazelluläre SeNPs umwandeln. Die SeNPs und mit Selen angereicherten Zellen könnten als Nano-Selen-Biomaterialien und mit Selen angereicherte Postbiotika entwickelt werden.

Selen (Se) ist ein essentielles Spurenelement (weniger als 0,01 % des menschlichen Körpergewichts) für den Wirt mit wichtigen biologischen Funktionen1. Selenmangel wirkt sich negativ auf die Gesundheit aus, beispielsweise beeinträchtigt ein chronischer Selenmangel die Funktion des Herz-Kreislauf-Systems und kann eine direkte Ursache für Herzinfarkt sein2,3,4. Selenmangel führt auch zu einer verminderten Immunität5, neurologischen Funktionsstörungen6,7 und der Kashin-Beck-Krankheit8. Selen wird im menschlichen Körper hauptsächlich über die Nahrung aufgenommen. Derzeit sind verschiedene Formen von Selenpräparaten im Handel erhältlich, die meisten davon sind jedoch anorganisches Selen, wie beispielsweise Natriumselenit. Da die wirksame Selenmenge nahe an der toxischen Menge liegt, hatte das anorganische Selen zusammen mit der geringeren biologischen Aktivität einen engen Sicherheitsbereich.9 Daher ist die Suche nach einer neuen Art von Selenergänzung (hohe biologische Aktivität und geringe Toxizität) zu einem Forschungsschwerpunkt geworden .

Kürzlich erregten Selen-Nanopartikel (SeNPs), eine neue Art von Selenpräparaten, Aufmerksamkeit. Studien haben gezeigt, dass SeNPs mehr physiologische Funktionen haben, wie z. B. entzündungshemmende10, antibakterielle, antioxidative11 und antitumorale12. Die Hauptmethoden zur Herstellung von SeNPs sind nun chemische und biologische Prozesse. Der chemische Prozess umfasst hauptsächlich die Reduktion von Na2SeO3 zu SeNPs durch Zugabe von Wirkstoffen im Redoxprozess, der zu einer geringeren Rückgewinnungsrate und mehr Schadstoffnebenprodukten führt13. Der biologische Prozess ist die Biokonversionsreaktion in Bakterienzellen, die effizient ist und der gesamte Prozess umweltfreundlich ist, weshalb er als die beste Wahl für die SeNP-Herstellung angesehen wird14.

Probiotika, wie sie von Milchsäurebakterien, Hefen, Bifidobacterium und Bacillus bekannt sind, wirken sich positiv auf die Gesundheit des Wirts aus, indem sie die Darmumgebung verbessern, Krankheiten vorbeugen, indem sie den pH-Wert im Darm senken und die Darmmikrobiota aufrechterhalten15. Darüber hinaus haben Probiotika auch die Funktion, dem Befall durch Krankheitserreger zu widerstehen und die Immunität des Wirts zu regulieren16. Postbiotika sind eine neue Kategorie von Biotika, die das Potenzial haben, gesundheitliche Vorteile zu bringen, im Gegensatz zu Probiotika jedoch keine lebenden Zellen erfordern. Postbiotika werden vom Konsensgremium der International Scientific Association of Probiotics and Prebiotics (ISAPP) als „Zubereitung unbelebter Mikroorganismen und/oder ihrer Bestandteile, die dem Wirt einen gesundheitlichen Nutzen verleiht“ definiert. Zu den postbiotischen Bestandteilen gehören kurzkettige Fettsäuren, Exopolysaccharide, Vitamine, Teichonsäuren, Bakteriozine, Enzyme und Peptide in einem nicht gereinigten inaktivierten Zellpräparat. Postbiotika haben gegenüber in Lebensmitteln eingearbeiteten Probiotika technologische Vorteile, da sie stabiler sind und ihre Lagerung, Handhabung und ihr Transport wirtschaftlicher sein können17.

Es wird berichtet, dass einige Probiotika Selen im Wachstumsmedium metabolisieren und Na2SeO3 durch Zellbiotransformation in rote SeNPs umwandeln können18,19. Bacillus ist ein grampositives aerobes Bakterium, das seit mindestens 60 Jahren als Probiotikum verwendet wird. Es wurde berichtet, dass B. megaterium ATCC 55.000 Na2SeO3 zu SeNPs20 reduzieren kann. Akçay et al. isolierten einen Stamm von B. megaterium EKT1 aus dem Boden und zeigten seine Fähigkeit zur Biosynthese von SeNPs21. Wenn daher die Leistung von SeNPs, die durch Reduktion des Bacillus-Probiotikums hergestellt werden, mit seinen probiotischen Eigenschaften kombiniert wird, kann der Komplex aus Bacillus und SeNPs als Postbiotika entwickelt werden, das nicht nur ausreichend Selen liefern und die Darmgesundheit verbessern kann. Lebensmittel mit bakteriellen Probiotika und Postbiotika sollen gesünder sein als solche, die nicht darin enthalten sind. Daher ist die Entwicklung von Lebensmitteln mit bakteriellen Probiotika und Postbiotika eine große Chance für die Forschung in den Bereichen Lebensmittelwissenschaft, Medizin und Ernährung sowie in der Lebensmittelindustrie17.

Um hochwirksame entzündungshemmende, antioxidative, sichere und ungiftige zusammengesetzte Nano-Selen-Materialien zu erhalten und sich auf die postbiotische Entwicklung vorzubereiten, wurde B. amyloliquefaciens C-1, ein in unserem Labor isolierter und gelagerter Patentstamm, zur Biosynthese von SeNPs verwendet. Die Se-angereicherten Kulturbedingungen wurden optimiert, die produzierten SeNPs wurden charakterisiert und die Biofunktionen und Sicherheit wurden bewertet.

Die Wachstumskurven von C-1 in Fermentationsmedium, das mit 0–150 μg/ml Na2SeO3 versorgt wurde, sind in Abb. 1A dargestellt. Es zeigte sich, dass C-1 bei 100 μg/ml Na2SeO3 und einem 10 %igen Samenkultur-Inokulum gut wachsen konnte. Um die optimale Fermentationszeit für mit Selen angereicherte C-1-Zellen zu bestätigen, wurde C-1 kontinuierlich mit 100 μg/ml Na2SeO3 und einem 10 %igen Inokulum 30 Stunden lang bei 30 °C inkubiert. Die OD600 wurde gemessen und die Ergebnisse sind in Abb. 1B dargestellt. Mit zunehmender Inkubationszeit wurde die rote Farbe der C-1-Zellen stärker, was auf die Produktion von SeNPS hinwies (Abb. 1C). Es zeigte sich, dass B. amyloliquefaciens C-1 bei 30 °C und 30-stündiger Fermentation eine maximale Se-Umwandlungsrate von 55,51 % pro OD aufwies.

Synthese von SeNPs und Herstellung von mit Selen angereichertem B. amyloliquefaciens C-1. Die 1, 3, 5, 7, 10 % frischen Übernachtkulturen von C-1 wurden separat in LB + G-Medium mit 0, 15, 30, 60, 100, 150 μg/ml Selenit subkultiviert. Und das Wachstum von C-1 wurde durch Messung der OD600 alle 60 Minuten bei 30 °C für 22 Stunden überwacht (A); die Fermentationskultur von C-1 in LB + G-Medium mit 100 μg/ml Na2SeO3 bei 0, 6, 12, 18, 24 und 30 h (B); Selenumwandlungsrate von C-1 in LB + G-Medium mit 100 μg/ml Na2SeO3 und mit 10 % Inokulum, die Zellen wurden alle 6 Stunden gesammelt. Selen wurde mit der spektrophotometrischen Methode (C) bestimmt.

Die SEM- und TEM-Analyse zeigte, dass es keinen signifikanten Unterschied in der Morphologie zwischen mit Selen angereicherten B. amyloliquefaciens C-1-Zellen (Abb. 2A, C) und C-1-Zellen (Abb. 2B, D) und den vegetativen Zellen gab alles in Stabform. TEM-Beobachtungen ergaben, dass die von C-1 produzierten biosynthetisierten SeNPs im Inneren der Zelle abgelagert und nach der Zelllyse in die Extrazellulärregion freigesetzt wurden. Die Energiespektren der SeNPs wurden mittels XPS beobachtet und die Ergebnisse zeigten, dass Kohlenstoff (C), Stickstoff (N), Sauerstoff (O) und Selen (Se) alle in der Zellbiomasse nachgewiesen wurden (Abb. 2E). Die Ergebnisse der EDX-Analyse sind in Abb. 2F dargestellt und zeigten das Vorhandensein von Kohlenstoff (C), Sauerstoff (O), Selen (Se), Osmium (Os), Schwefel (S) und Kupfer (Cu) mit einer relativen Konzentration von 74,62, 8,46 , 5,22, 0,62, 8,84 bzw. 2,23 % in mit Selen angereicherten C-1-Zellen.

Charakterisierung von mit Selen angereichertem B. amyloliquefaciens C-1 und den produzierten SeNPs. Die Morphologie der C-1-Zellen wurde durch SEM beobachtet, das mit (A) und ohne (B) 100 μg/ml Na2SeO3 kultiviert wurde, und durch TEM, das mit (C) und ohne (D) 100 μg/ml Na2SeO3 kultiviert wurde; und die Zusammensetzung der Elemente Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor, Schwefel und Selen in mit Se angereichertem C-1 wurden mittels XPS (E) und EDS (F) analysiert.

Die Fähigkeit von mit Selen angereichertem C-1 und C-1 zum Abfangen freier Radikale an O2−, OH- und DPPH wurde untersucht und die Ergebnisse sind in Abb. 3 dargestellt.

Antioxidative Eigenschaften von mit Selen angereichertem C-1 in Bezug auf die Abfangrate von Superoxidradikalen (A), Hydroxylradikalen (B) und DPPH-Radikalen (C). Die statistische Signifikanz wurde durch eine einfaktorielle ANOVA berechnet.

Abbildung 3A zeigte, dass sowohl mit Selen angereichertes C-1 als auch C-1 die Fähigkeit hatten, O2− abzufangen. Und C-1 zeigte eine höhere Abfangfähigkeit als mit Selen angereichertes C-1, wenn die Konzentration höher als 10 mg/ml war (10 mg/ml: 75,95 % vs. 69,47 %, P = 0,001; 20 mg/ml: 77,42 %). vs. 67,93 %, P < 0,001; 30 mg/ml: 78,24 % vs. 65,99 %, P = 0,006). Abbildung 3B zeigte, dass sowohl mit Selen angereichertes C-1 als auch C-1 die Fähigkeit hatten, OH- abzufangen. Und mit Selen angereichertes C-1 zeigte eine höhere Abfangfähigkeit als C-1 bei weniger als 5 mg/ml (2,5 mg/ml: 92,90 % vs. 84,81 %, P < 0,001; 5 mg/ml: 92,10 % vs. 88,75). %, P < 0,001). Und es gab keinen signifikanten Unterschied in der Abfangfähigkeit verschiedener Konzentrationen von mit Selen angereichertem C-1, die mehr als 92 % betrugen. Abbildung 3C zeigte, dass mit Selen angereichertes C-1 dosisabhängig eine höhere Fähigkeit zum Abfangen von DPPH-Radikalen aufwies als C-1, insbesondere bei mehr als 10 mg/ml (10 mg/ml: 71,98 % vs. 52,95). %, P = 0,001; 20 mg/ml: 75,85 % vs. 52,31 %, P = 0,019; 30 mg/ml: 80,16 % vs. 50,42 %, P < 0,001).

Im Zelllebensfähigkeitstest, der mit unterschiedlichen Konzentrationen an C-1- und mit Selen angereicherten C-1-Bakterienzellen behandelt wurde, hatten im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe sowohl die C-1- als auch die mit Selen angereicherte Behandlung keine toxischen Auswirkungen auf das Wachstum von Caco-2-Zellen bei Konzentrationen von 8 × 103, 1 × 104, 8 × 104, 1 × 105 KBE/ml (P > 0,05) (Tabelle 1). In den folgenden Experimenten wurden die Konzentrationen von 8 × 103, 1 × 104, 8 × 104 und 1 × 105 KBE/ml von C-1 und mit Selen angereichertem C-1 bei der Behandlung der Caco-2-Zellen ausgewählt.

Die Zellmembranintegrität von Caco-2-Zellen wurde durch den Nachweis der LDH-Aktivität im Zellüberstand bewertet. Die Ergebnisse sind in Abb. 4 dargestellt. Im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöhte die Behandlung mit S. typhimurium ATCC14028 die LDH-Aktivität signifikant (292,99 U/L vs . 219,94 U/L, P < 0,001), was auf die Auslösung von Zellschäden hinweist. Die S+C-1- und S+C-1-Se-Gruppen hatten signifikant niedrigere LDH-Aktivitäten als die S. typhimurium-Schadensgruppe (144,58 U/L vs. 219,94 U/L, P < 0,001; C-1-Se: 111,35 U). /L vs. 219,94 ± 11,94 U/L, P < 0,001), was darauf hindeutet, dass die durch S. typhimurium verursachte Schädigung der Zellmembran teilweise durch Probiotika repariert werden kann.

Schützt die Wirkung von mit Selen angereichertem B. amyloliquefaciens C-1 auf die Integrität der Caco-2-Zellmembran, die durch S. typhimurium ATCC14028 durch einen LDH-Aktivitätstest in Frage gestellt wird. S (S. typhimurium ATCC14028-Behandlung); C-1+S (2 Stunden Inkubation mit C-1 zuerst, dann S. typhimurium hinzugefügt und weitere 2 Stunden inkubiert); S+C-1 (zuerst 2 Stunden Inkubation mit S. typhimurium, dann Zugabe von C-1 und weitere 2 Stunden Inkubation); C-1-Se+S (2-stündige Inkubation mit Selen-angereichertem C-1, dann Zugabe von S. typhimurium und weitere 2-stündige Inkubation); SC-1+Se (zuerst 2 Stunden Inkubation mit S. typhimurium, dann Zugabe von mit Selen angereichertem C-1 und weitere 2 Stunden Inkubation). Die statistische Signifikanz wurde durch eine einfaktorielle ANOVA berechnet.

Die Lebensfähigkeit der Caco-2-Zellen nahm mit steigender H2O2-Konzentration allmählich ab, was beweist, dass die Zellen oxidativem Stress ausgesetzt waren. Im Vergleich zur Negativkontrolle (100 % Zelllebensfähigkeit) verringerte sich die Zelllebensfähigkeit getrennt nach 4-stündiger Behandlung um 100, 200, 400, 800, 1200, 1600 und 2000 auf 98,27, 89,41, 57,47, 47,41, 47,13, 44,33 und 42,49 % μM H2O2 (P < 0,001). Für das folgende Experiment wurden 400 μM H2O2 verwendet, um das Zellstressmodell zu erstellen.

Wie in Abb. 5 gezeigt, kann die Vorbehandlung von C-1- und Selen-angereicherten C-1-Gruppen im Vergleich zur H2O2-belasteten Gruppe die H2O2-induzierte Hemmung des Zellwachstums lindern. Unter Inkubation von 8 × 103 und 1 × 104 KBE/ml Bakterienzellen war der Effekt am signifikantesten (C-1: 108,51 % vs. 60,12 %, P < 0,001; 114,5 % vs. 60,12 %, P < 0,001; Selen- angereichertes C-1: 111,53 % vs. 60,12 %, P < 0,001; 115,88 % vs. 60,12 %, P < 0,001). Und mit Selen angereichertes C-1 und C-1 mit 8 × 103 und 1 × 104 KBE/ml wurden als Vorbehandlung in den folgenden Tests ausgewählt, um die Expression entzündlicher Zytokine zu beobachten.

Die Wirkung von B. amyloliquefaciens C-1 (A) und Se-angereichertem C-1 (B) auf durch H2O2 induzierte oxidativ gestresste Caco-2-Zellen zeigte sich in der Lebensfähigkeit der Zellen. Die statistische Signifikanz wurde durch eine einfaktorielle ANOVA berechnet.

q-RT-PCR wurde verwendet, um die relativen mRNA-Expressionsniveaus der Zytokine IL-8, IL-1β und TNF-α nachzuweisen, und die Ergebnisse sind in Abb. 6A-C dargestellt. Im Vergleich zur Negativkontrolle waren die mRNA-Expressionsniveaus von IL-8, IL-1β und TNF-α im oxidativen Modell um das 3,487-fache, das 5,000-fache und das 9,331-fache getrennt signifikant erhöht (P < 0,001).

Auswirkungen von Se-angereichertem B. amyloliquefaciens C-1 auf Entzündungsfaktoren von IL-8 (A), IL-1β (B) und TNF-α (C) in oxidativ gestressten Caco-2-Zellen. Die statistische Signifikanz wurde durch eine einfaktorielle ANOVA berechnet.

Verglichen mit der 3,487-mal höheren Expression von IL-8 im oxidativen Modell konnte die mit Selen angereicherte C-1-Gruppe in hoher Konzentration diese signifikant auf das 1,687-fache reduzieren (P = 0,01); Verglichen mit der 5.000-mal höher exprimierten IL-1β-Expression im oxidativen Modell zeigten alle vier Behandlungsgruppen eine signifikant verringerte Expression von IL-1β (2.432-mal bei 1 × 104 KBE/ml C-1; 1.258-mal bei niedriger C-1-Konzentration). ; 1,031-fach in 1 × 104 KBE/ml Selen-angereichertem C-1; 2,371-fach in 8 × 103 KBE/ml Selen-angereichertem C-1; P < 0,001). Und die Behandlung mit 1 × 104 KBE/ml Selen-angereichertem C-1 hatte den niedrigsten mRNA-Expressionsspiegel von IL-1β.

Verglichen mit der 9,331-fach höheren Expression von TNF-α im oxidativen Modell zeigten alle vier Behandlungsgruppen eine signifikant verringerte Expression von TNF-α (7,837-fach bei 1 × 104 KBE/ml C-1; 4,687-fach bei 8 × 103 KBE/ml). C-1; 2,677-fach in 1 × 104 KBE/ml Selen-angereichertem C-1; 2,974-fach in 8 × 103 KBE/ml Selen-angereichertem C-1; P < 0,001). Und das mRNA-Expressionsniveau von TNF-α war nach der Behandlung mit 1 × 104 KBE/ml Selen-angereichertem C-1 am niedrigsten. Alle Ergebnisse zeigten die hohe Fähigkeit von mit Selen angereichertem C-1, oxidativen Stress von Caco-2-Zellen zu lindern.

Die Ergebnisse der Genexpression des Zell-Tight-Junction-Strukturproteins (Claudin-1, ZO-1, Occludin) sind in Abb. 7A-C dargestellt. Im Vergleich zur Kontrollgruppe war die relative Expression von Claudin-1, ZO-1 und Occludin im oxidativen Modell (mit H2O2 behandelte Gruppe) signifikant auf 0,611, 0,472 und 0,307 (P < 0,001) verringert, was auf den oxidativen Stress der Zellen hinwies, der die Zellen reduzierte Verbindung und erhöhte Permeabilität der Zellmembran. Während die Inkubation von mit Selen angereichertem C-1 und C-1 den Tight-Junction-Zustand der Zellen deutlich wiederherstellte, verringerte sich gleichzeitig die Permeabilität der Zellmembran. Im Vergleich zum oxidativen Modell erhöhte 8 × 103 KBE/ml mit Selen angereichertes C-1 das Expressionsniveau von Claudin-1 signifikant (0,971 vs. 0,611, P < 0,001); Und die Expression von Occludin war bei der Behandlung mit 1 × 104 KBE/ml C-1 am höchsten (0,750 vs. 0,307, P < 0,001); Die Expression von ZO-1 war in den Behandlungsgruppen nicht signifikant erhöht (P > 0,05).

Auswirkungen von Se-angereichertem B. amyloliquefaciens C-1 auf Membranpermeabilitäts-bezogene Proteine von Claudin-1 (A), ZO-1 (B) und Occludin (C) in oxidativ gestressten Caco-2-Zellen. Die statistische Signifikanz wurde durch eine einfaktorielle ANOVA berechnet.

Die RNA wurde aus B. amyloliquefaciens C-1 und Selen-angereicherten C-1-Zellen extrahiert. Die RNA-Proben wurden zur Qualitätskontrolle getestet und qualitätsgetrimmte Lesevorgänge wurden mit Bowtie2 v2.2.8 auf C-1 abgebildet, auf Ribosomen-RNA kartierte Lesevorgänge wurden entfernt. Die beibehaltenen Messwerte wurden mit dem Referenzgenom von C-1 abgeglichen, um bekannte Gene zu identifizieren und die Genexpression durch RSEM zu berechnen. Das Ergebnis wurde in der Ergänzungstabelle S2 zusammengefasst.

In den Ergebnissen der Transkriptomanalyse gab es 381 Differenzialgene im vegetativen Stadium, darunter 103 hochregulierte und 278 herunterregulierte Gene; und es gab 1381 Differenzialgene im Sporulationsstadium, darunter 719 hochregulierte und 662 herunterregulierte Gene (DESeq2 mit |log2 (Fold Change)|> 1 und Padj <0,05) (Abb. 8A, B, Ergänzungstabelle S3). Dies weist darauf hin, dass Na2SeO3 einen Einfluss auf das Gentranskriptionsniveau von C-1 hat, insbesondere im Sporulationsstadium. Die differentiellen Transkriptionsgene der mit Selen angereicherten C-1-Zellen im Vergleich zu C-1 sind in Tabelle 2 aufgeführt (|log2(Fold Change)|> 5, Padj < 0,05).

Vergleich der Genexpression auf Transkriptionsebene in B. amyloliquefaciens C-1 in LB + G-Medium mit und ohne 100 μg/ml Na2SeO3. Im Volcano Plot wurden Gene mit signifikant unterschiedlicher Expression (Fold Change > 0 und Padj < 0,05; Se-angereichertes C-1 vs. C-1) in Grün (herunterreguliert), Rot (hochreguliert) und Blau dargestellt (nicht signifikant unterschiedliche Expression) im vegetativen Stadium (A) und im Sporulationsstadium (B). Die unterschiedlich exprimierten Gene wurden analysiert und im KEGG-Dotplot im vegetativen Stadium (C) und im Sporulationsstadium (D) dargestellt.

Eine Anreicherungsanalyse dieser verschiedenen Transkriptgene wurde durchgeführt, um die biologischen Wirkungen und die entsprechenden Signalwege zu untersuchen, die bei der GO- und KEGG-Analyse signifikant miteinander verbunden sind. In der GO-Funktionsanreicherungsanalyse (Ergänzungstabelle S4) wurden alle Differenzgene signifikant in 3 GO-Begriffen angereichert, einschließlich proteinhaltiger komplexer Hydrolaseaktivität, hydrolysierender O-Glykosylverbindungen und Hydrolaseaktivität, die im vegetativen Stadium auf Glykosylbindungen einwirkt. Im Sporulationsstadium wurden alle differenziellen Gene signifikant in 42 GO-Begriffen angereichert und sie gehören alle zum biologischen Prozess. Es gab drei Begriffe, die herunterreguliert wurden, darunter Chemotaxis, Taxis und Fortbewegung. Es deutete darauf hin, dass die Chemotaxis und Fortbewegung von B. amyloliquefaciens abnahm, wenn dem Fermentationsmedium Na2SeO3 zugeführt wurde. Es gab 39 Begriffe, die hochreguliert wurden, die Begriffe, bei denen die am unterschiedlichsten angereicherten Gene hauptsächlich am Stoffwechselprozess von Nukleobasen enthaltenden Verbindungen, am Stoffwechselprozess von Nukleinsäuren, am Stoffwechselprozess von zellulären aromatischen Verbindungen, am Stoffwechselprozess von Heterocyclen und am Stoffwechselprozess von zellulären Stickstoffverbindungen beteiligt waren Prozess, Stoffwechselprozess organischer zyklischer Verbindungen, zellulärer Biosyntheseprozess, Biosyntheseprozess organischer Substanzen, Stoffwechselprozess Makromoleküle usw.

In der KEGG-Signalweganreicherungsanalyse (Ergänzungstabelle S5) wurden alle Differenzgene im vegetativen Stadium signifikant in vier Signalwegen (Stärke- und Saccharosestoffwechsel, Phosphotransferasesystem, Purinstoffwechsel, oxidative Phosphorylierung) angereichert, die alle hochreguliert waren (Abb. 8C). ). Im Sporulationsstadium waren alle differenziellen Gene signifikant in 8 Signalwegen angereichert (Abb. 8D), wobei es 2 hochregulierte Signalwege (Glycerophospholipid-Metabolismus, Fructose- und Mannose-Metabolismus) und 6 herunterregulierte Signalwege (Citratzyklus, bakterielle Chemotaxis, Glykolyse/Glukoneogenese, Glyoxylat- und Dicarboxylatstoffwechsel, oxidative Phosphorylierung und Kohlenstoffstoffwechsel). Dies deutete darauf hin, dass die Stoffwechselaktivität von C-1 bei Zugabe von Na2SeO3 im späteren Wachstumsstadium abnahm, die Ansammlung von Stoffwechselabfällen das Wachstum hemmen würde und seine Chemotaxis- und Kolonisierungskapazität abnahm, was mit der Biokonversionskurve von C-1 übereinstimmt Na2SeO3 zu SeNPs durch C-1 (Abb. 1B).

Die q-RT-PCR-Ergebnisse von drei zufällig ausgewählten, unterschiedlich exprimierten Genen sind in der ergänzenden Abbildung S1 dargestellt. Die Expression dieser drei Gene stimmte mit den Ergebnissen der Transkriptomanalyse mit einem R2 von 0,966 überein.

Selen ist ein wesentliches biologisches Element für alle lebenden Organismen. Die Menge an Selen im menschlichen Gewebe variiert je nach Ernährung. Chronischer Selenmangel könnte zu schweren Erkrankungen führen2,3,4. In den letzten Jahren hat mit der zunehmenden Nahrungsergänzung von Selen die Anwendung der mikrobiellen Selenitreduktion in SeNPs an Aufmerksamkeit gewonnen. Allerdings gibt es Einschränkungen bei der Verwendung von Mikroorganismen zur Synthese von SeNPs, wie z. B. eine streng anaerobe Umgebung für das Wachstum von Milchsäurebakterien, teure Fermentationsausrüstung und höhere Kosten22. Während die Entwicklung von mit Selen angereicherten Probiotika mit aeroben Bakterien möglicherweise eine weitere bessere Wahl ist.

Bacillus-Probiotika werden aerob reproduziert und könnten die Darmmikrobiota regulieren, die Immunität des Wirts verbessern und Darmerkrankungen durch Kolonisierung im Darmtrakt reduzieren. Ashengroph et al. isolierten einen Stamm von Bacillus SRB04 an der Küste des Kaspischen Meeres und bestätigten dessen Fähigkeit zur Selenanreicherung23. Fischer et al. isolierten Bacillus Safensis JG-B5T aus dem Boden und zeigten, dass es instabile SeNPs produzierte24. In ähnlicher Weise haben wir in dieser Studie herausgefunden, dass B. amyloliquefaciens C-1 in einer Konzentration von 100 μg/ml Na2SeO3, 10 % C-1-Samenkultur, 30 Stunden lang bei 30 °C inkubiert, Na2SeO3 offensichtlich mit hoher Umwandlung zu SeNPs reduziert Rate von 55,51 % pro OD.

Es wurde berichtet, dass die Anzahl der Bakterienzellen nach der mit Selen angereicherten Fermentation von B. paralicheniformis SR14 ohne morphologische Veränderung abnahm25. In unserer Studie führte die Zugabe von Na2SeO3 zum Medium auch zu einer Verringerung der C-1-Zellzahl, was auf die Toxizität von anorganischem Na2SeO3 für Bakterienzellen hinweist. Währenddessen gab es bei C-1-Zellen im SEM keine Veränderungen in der Morphologie. Der Syntheseort von SeNPs kann intrazellulär, extrazellulär oder membrangebunden sein. Von Bakterien produzierte SeNPs sammelten sich intrazellulär im mittleren und späten Stadium der exponentiellen Wachstumsphase an und wurden während der stationären Phase in das Medium sezerniert. Liu et al. isolierte ein probiotisches Enterococcus durans A8-1 und bestätigte die akkumulierten intrazellulären und extrazellulären SeNPs26. Die TEM-Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass die SeNPs offensichtlich innerhalb von C-1-Zellen aggregiert waren.

Für die beobachtete Zytotoxizität von mit Selen angereichertem C-1 bei Konzentrationen von mehr als 8 × 105 KBE/ml haben Studien gezeigt, dass der Toxizitätsbereich von SeNPs breiter ist als der von Selen, was jedoch nicht bedeutet, dass Nano-Selen vollständig ist ungiftig, nur dass es innerhalb eines bestimmten Bereichs sicher ist19. Daher ist die Sicherheitsbewertung von SeNPs, selbst wenn sie durch Probiotika hergestellt werden, weiterhin notwendig.

Die Entwicklung natürlicher und sicherer Antioxidantien hat Aufmerksamkeit erregt. SeNPs haben nachweislich eine bessere antioxidative Aktivität, was zu einer neuen Ergänzung zu Antioxidantien werden wird. Studien haben gezeigt, dass mehr als 95 % der freien Radikale zu Sauerstoffradikalen wie O2− und OH− Radikalen gehören. Im Gegensatz zu Sauerstoffradikalen handelt es sich bei DPPH um synthetische organische Radikale, die häufig zur Bewertung der antioxidativen Kapazität biologischer Proben eingesetzt werden. Shakibaie et al. isolierten einen Stamm selentoleranter Milchsäurebakterien aus traditionellen iranischen Milchprodukten, der 3,16 mmol/L Selenit vertragen konnte und eine gute Fähigkeit zum Abfangen freier Radikale zeigte27. In dieser Studie zeigte mit Selen angereichertes C-1 eine Abfangfähigkeit gegen O2−, OH- und DPPH, wobei die Abfangfähigkeit von OH- am höchsten war.

Caco-2-Zellen werden verwendet, um Modelle des menschlichen oxidativen Stresses im Darm zu erstellen, um Antioxidantien bei der Behandlung und Vorbeugung von oxidativen Schäden im Darm zu untersuchen. Xu et al. fanden heraus, dass von Lactobacillus casei ATCC393 produzierte SeNPs die durch E. coli K88 verursachte Schädigung der Darmbarrierefunktion schützen und die Expression von IL-1β und TNF-α28 reduzieren können. In unserer Studie wurde das oxidative Stressmodell in Caco-2-Zellen durch H2O2 induziert, und das getestete mit Selen angereicherte C-1 hatte das Potenzial, die Entzündungsreaktion bei einer bestimmten Konzentration zu hemmen, und es wurden auch ähnliche Expressionsprofile für Zytokine beobachtet. Die oben genannten Ergebnisse bilden eine Grundlage für die spätere Antioxidantienforschung.

Die Barrierestruktur des Darms spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung normaler physiologischer Funktionen29. Tight Junction (TJ) ist ein wichtiger Verbindungsmodus zwischen Darmschleimhautzellen. TJ ist ein multifunktionaler Komplex, der aus mehreren Proteinen besteht, hauptsächlich Transmembranproteinen (Claudins, Occludin) und zytoplasmatischen Proteinen (ZO-1). Wenn Transmembranproteine und zytoplasmatische Proteine degeneriert und beschädigt oder unzureichend synthetisiert werden, wird TJ geschädigt und die interzelluläre Permeabilität deutlich erhöht, was zum Eindringen von Makromolekülen wie Darmbakterien in den Kreislauf führt (metabolische Endotoxämie)30. Die Ergebnisse dieser Studie ergaben, dass die H2O2-Behandlung von Caco-2-Zellen zu einer verminderten Expression von Claudin-1, Occludin und ZO-1 führen könnte, was auch von Somrudee et al.31 berichtet wurde. Im Vergleich zum H2O2-belasteten Modell könnte mit Selen angereichertes C-1 die Expression von Claudin-1 und Occludin, nicht von ZO-1, deutlich steigern. Somrudee et al. fanden heraus, dass H2O2 zum Abbau von Tight Junctions und damit zu einer erhöhten Expression von ZO-1 und Occludin31 führen kann.

Sicherheit für die Darmzellen, höhere Fähigkeit zum Abfangen freier Radikale, offensichtliche entzündungshemmende Wirkung – all diese Merkmale weisen auf die mögliche Entwicklung dieses Bakteriums hin. Um den Mechanismus der C-1-Metabolisierung von Na2SeO3 zu untersuchen, wurde die Transkriptomsequenzierung verwendet, um die funktionelle Klassifizierung und die durch DEGs angereicherten Schlüsselwege zu analysieren. Die ATP-Synthetase spielt eine zentrale Rolle bei der oxidativen Phosphorylierung. Bakterielle ATP-Synthetase besteht aus der hydrophoben Domäne F0 in der Membran und dem löslichen hydrophilen Kopf F1 außerhalb der Membran. Die Gene atpA, atpD und atpG kodieren für die Untereinheiten α3, β3 und γ von F1. Long et al. zeigten, dass unter dem Stress von Mangan die Überexpression des atpA-Gens die Anzahl der Bakterien logarithmisch erhöhen konnte und das atpD-Gen ebenfalls positiv reguliert wurde und an der Stressreaktion beteiligt war32. Unsere Studie zeigte, dass mit Selen angereichertes C-1 im GO-Term, der mit dem Proteinkomplex im vegetativen Stadium verbunden ist, signifikant angereichert und herunterreguliert wurde und dass die Gene atpA, atpD, rplD, rplB, rplP, rplN und rpsC alle nach unten zeigten Ausdruck. Bei der bakteriellen Chemotaxis handelt es sich um die gezielte Bewegung von Bakterien in Richtung eines vorteilhaften chemischen Gradienten oder weg von einem toxischen chemischen Gradienten durch Flagellen. Quan et al. Bei der konstruierten fliG-Gen-Knockout-Mutante von Campylobacter jejuni NCTC11168 waren die Chemotaxis und die Kolonisierungsfähigkeit der Mutante verringert, was darauf hinweist, dass das fliG-Gen für die Kolonisierungschemotaxis von C. jejuni notwendig war. FliM bildet den C-Ring der Flagellenmatrix und ist an der Änderung der Richtung der Flagellenrotation beteiligt33. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass im Sporulationsstadium die bakterielle Chemotaxis (bao02030) herunterreguliert wurde und der GO-Term im Zusammenhang mit der bakteriellen Chemotaxis signifikant angereichert war und Flagellen-bezogene Gene (flgG, fliM, fliL, fliJ) herunterreguliert wurden. reguliert durch mit Selen angereichertes C-1. Es wird vermutet, dass B. amyloliquefaciens C-1 seine Motilität, Chemotaxis und Kolonisierungsfähigkeit aufgrund eines geringeren ATP-Verbrauchs während der Sporulationsphase als Reaktion auf Selen verringert hat.

Mit der verifizierten Leistung von SeNPs, die durch Reduktion des Probiotikums B. amyloliquefaciens C-1 hergestellt werden, kann der Komplex aus Bacillus und SeNPs als Postbiotika entwickelt werden, die als Lebensmittelprodukte mit bakteriellen Probiotika und Postbiotika entwickelt werden können und große Chancen für die Forschung in der Lebensmittelwissenschaft bieten , Medizin und Ernährung sowie in der Lebensmittelindustrie.

Und es gibt immer noch Einschränkungen in dieser Studie. Im nächsten Schritt muss zunächst die Sicherheitsbewertung am Tiermodell durchgeführt, ein erfolgreiches und zuverlässiges Tiermodell für oxidativen Stress erstellt und die Wirksamkeit von mit Selen angereichertem C-1 überprüft werden ist für die Untersuchung des Mechanismus von großer Bedeutung. Bei der Herstellung von Postbiotika ist es sehr wichtig, Fermentationsprodukte zu verarbeiten, Zellen zu inaktivieren und wirksame Wirkstoffe beizubehalten. Dies wird unser Verständnis für die gesundheitlichen Verbesserungen von mit Mineralien angereicherten Postbiotika, einschließlich antioxidativer Funktionen, verbessern und ihre Perspektive auf die mikrobielle Therapie zur Vorbeugung hervorheben und bedrohen Darmerkrankungen.

B. amyloliquefaciens C-1, ein patentierter Stamm, konnte Na2SeO3 durch Inkubation mit 100 μg/ml Na2SeO3 für 30 Stunden Fermentation bei 30 °C in SeNPs umwandeln, mit einer Bioumwandlungsrate von bis zu 55,51 % pro OD. Mit Selen angereichertes C-1 hatte das große Potenzial, als Postbiotika mit guten antioxidativen, antibakteriellen und entzündungshemmenden Eigenschaften entwickelt zu werden und die Integrität des Darmepithels zu schützen. Während des Prozesses der SeNP-Synthese verlangsamten sich die Produktionskapazität und der Stoffwechsel von C-1-Zellen im vegetativen Stadium und die Beweglichkeit nahm ab. Im Sporulationsstadium wurde eine große Menge Na2SeO3 in die Zelle transportiert und die synthetisierten SeNPs sammelten sich intrazellulär an. Der Metabolismus von Na2SeO3 durch C-1 kann für die Entwicklung von Bio-SeNPs und Postbiotika genutzt werden und kann auch zur biologischen Sanierung von Schwermetallbelastungen in der Umwelt eingesetzt werden.

B. amyloliquefaciens C-1 war ein patentierter Stamm, der aus verzehrfertigen Fruchtproben im Mikrobiologielabor des Forschungszentrums für Ernährung und Lebensmittelsicherheitstechnik der Provinz Shaanxi der Xi'an Jiaotong-Universität isoliert und im China Center for Type gelagert wurde Kultursammlung (CCTCC-NR. M2012177). Und die Genomsequenz von C-1 wurde bei NCBI mit der Zugangsnummer SRP127533 eingereicht.

C-1 wird in LB + 1 % Glucose (LB + G)-Medium inokuliert und kultiviert und aerob bei 30 °C inkubiert. Salmonella typhimurium ATCC14028, das zur Belastung der Caco-2-Zellen verwendet wurde, wurde in unserem Labor gelagert und in LB-Medium bei 37 °C kultiviert.

Vom Menschen stammende Darmepithelzellen Caco-2 wurden als in vitro getestetes Modell für C-1-Probiotika verwendet und in RMPI 1640-Medium (enthaltend 20 % fötales Rinderserum, 1 % Antibiotika) in einem 5 % CO2-Inkubator bei 37 °C kultiviert . Nachdem die Zellen Konfluenz erreicht hatten, wurden sie in allen nachfolgenden experimentellen Analysen verwendet.

Zur Bestimmung der optischen Selenitreduktion und der mit Selen angereicherten Kulturbedingungen für C-1, 1, 3, 5, 7 und 10 % wurden frische Übernachtkulturen von C-1-Zellen in 250-ml-Erlenmeyerkolben mit 100 ml LB + subkultiviert G-Medium mit 0, 15, 30, 60, 100 und 150 μg/ml Na2SeO3, separat. Die Bakterienkulturen wurden bei 30 °C auf einem Orbitalschüttler bei 200 U/min inkubiert. Selenit im Medium und elementares Se in Bakterienzellen wurden durch spektrophotometrische Methoden wie beschrieben bestimmt34.

Nach Bestätigung des Prozentsatzes der optischen Subkultur und der zugeführten Menge an Na2SeO3 im Fermentationsmedium wurde das mit Selen angereicherte Wachstum von C-1 durch Messung der optischen Dichte bei 600 nm alle 60 Minuten bei 30 °C über 22 Stunden mit einem Mikroplatten-Lesegerät überwacht (Tecan Infinite M200, Schweiz). Die erhaltenen Werte wurden als Selenitreduktionsraten und elementare Se-Bildung pro OD600 ausgedrückt.

Die OD600 der C-1-Übernachtkultur wurde auf 1,0 eingestellt und eine 10 %ige Subkultur wurde in einen Kolben mit 100 ml LB + G-Medium, versorgt mit 100 μg/ml Na2SeO3, überführt und 30 Stunden lang bei 30 °C inkubiert. Die Zellen wurden durch 15-minütige Zentrifugation bei 10.000 g und 4 °C gesammelt und dreimal mit PBS gewaschen. Zur morphologischen Analyse wurden die gesammelten C-1-Zellen mit 2 % Glutaraldehyd fixiert und an das Instrumental Analysis Center der Xi'an Jiaotong University für SEM (Hitachi SU3500, Japan), EDS (ThermoFisher ESCALAB Xi+ EDX, UK) und TEM übertragen ( ThermoFisher Talos L120C, USA) Analyse. EDS kann in Kombination mit SEM zur Analyse der Elementtypen in getesteten Materialien verwendet werden. Zum Nachweis des Elementgehalts in den mit Selen angereicherten C-1-Zellen wurden die Zellen bei 45 °C auf ein konstantes Gewicht getrocknet und mit XPS (Thermo Fisher ESCALAB Xi+ XPS, UK) im Instrumental Analysis Centre of Xi' analysiert. eine Jiaotong-Universität.

Um die Fähigkeit von mit Selen angereichertem B. amyloliquefaciens C-1 zu bewerten, oxidativem Stress zu widerstehen, wurde ein In-vitro-Test auf die Aktivität freier Radikale durchgeführt, der Superoxidanionen (O2−), Hydroxyl(OH−) und DPPH-Radikale durch Kits umfasste ( Katalognummer als A052-1-1, A018-1-1, A153-1-1, Nanjing Jiancheng Institute of Bioengineering, Nanjing, China). Zunächst wurde die Bakteriensuspension zentrifugiert und mit sterilisiertem doppelt destilliertem Wasser resuspendiert. Die Konzentrationen wurden auf 2,5, 5, 10, 20 und 30 mg/ml eingestellt. Anschließend wurden die vom Hersteller empfohlenen Anweisungen des Kits befolgt. Die empfohlene Messung der optischen Dichte zum Nachweis von O2−-, OH−- und DPPH-Radikalen beträgt jeweils 550, 550 und 517 nm. Das mit Selen angereicherte C-1 und C-1 waren die getesteten Proben, da ddH2O als Blindkontrolle eingestellt wurde35.

Die Ergebnisse wurden wie folgt als Spülaktivität ausgedrückt.

A0: OD für die Blindkontrolle, A1: OD für die getestete Probe.

Die gesamte Fermentation von C-1 und mit Selen angereicherten C-1-Kulturen wurde mit RMPI 1640-Medium verdünnt, um die Konzentrationen der Bakterienzellen auf 8 × 106, 1 × 106, 8 × 105, 1 × 105, 8 × 104, 1 × 104 einzustellen. 8 × 103 KBE/ml. Caco-2-Zellen (2,5 × 104 Zellen/Vertiefung) wurden über Nacht in Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät. Anschließend wurden die Zellen 20 Stunden lang mit unterschiedlichen Konzentrationen von C-1 und mit Selen angereichertem C-1 inkubiert. Nach der Behandlung wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und mit einer 5 mg/ml MTT-Arbeitslösung 4 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Dann wurde der Überstand entfernt und die Kultur in 150 μl DMSO erneut suspendiert, um die MTT-Formazan-Kristalle aufzulösen, gefolgt von 15-minütigem Mischen. Die OD490 wurde mit einem Mikroplattenlesegerät (Tecan Infinite M200, Schweiz) gemessen. Die Wirkung von C-1 und der mit Selen angereicherten C-1-Kultur auf die Lebensfähigkeit von Caco-2-Zellen wurde als Prozentsatz lebensfähiger Zellen in jeder Behandlungsgruppe im Verhältnis zu den unbehandelten Zellen bewertet und ihnen wurde willkürlich eine Lebensfähigkeit von 100 % zugewiesen.

B1: OD490 für C-1-Behandlung oder mit Selen angereicherte C-1-Behandlung, B2: OD490 für Negativkontrollgruppe.

Die Zytotoxizität von Laktatdehydrogenase (LDH) wurde im Kulturmedium von Caco-2-Zellen getestet, um die Integrität der Zellmembran zu zeigen. Eine höhere LDH-Aktivität bedeutet eine Schädigung der Zellmembran und eine geringere Integrität der Zellmembran36. Die Methode wurde zur Messung der Zelllebensfähigkeit verwendet und wie zuvor beschrieben durchgeführt26. Caco-2-Zellen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen ausgesät und in einer einzigen Schicht kultiviert, dann wurden 4 Behandlungsgruppen als C-1+S festgelegt (2-stündige Inkubation mit 1 × 107 KBE/ml C-1-Kultur, dann 1 × 107 KBE/ml S. typhimurium ATCC14028 hinzugefügt und weitere 2 Stunden inkubiert); S+C-1 (2 h Inkubation mit 1 × 107 KBE/ml S. typhimurium ATCC14028-Kultur, dann 1 × 107 KBE/ml C-1 hinzugefügt und weitere 2 h inkubiert); C-1-Se+S (2 h Inkubation mit 1 × 107 KBE/ml Selen-angereicherter C-1-Kultur, dann 1 × 107 KBE/ml S. typhimurium ATCC14028 hinzugefügt und weitere 2 h inkubiert); SC-1+Se (2 h Inkubation mit 1 × 107 KBE/ml S. typhimurium ATCC14028-Kultur, dann 1 × 107 KBE/ml mit Selen angereichertes C-1 hinzugefügt und weitere 2 h inkubiert). Als Kontrolle wurden Caco-2-Zellen ohne jegliche Behandlung verwendet. Nach der Inkubation wurde der Überstand der Zellkultur nach 10-minütiger Zentrifugation bei 1500 U/min und 4 °C gesammelt. Das durch beschädigte Membranen in den Kulturüberstand freigesetzte LDH wurde spektrophotometrisch mit dem LDH Cytotoxicity Assay Kit (Nanjing Jiancheng Technology Co., Ltd., Nanjing, China) gemäß dem Protokoll des Herstellers gemessen.

Caco-2-Zellen (2,5 × 104 Zellen pro Vertiefung) wurden über Nacht in Platten mit 96 Vertiefungen in einer einzigen Schicht ausgesät. Die Zellen wurden 20 Stunden lang mit C-1 und mit Selen angereichertem C-1 (1 × 105, 8 × 104, 1 × 104, 8 × 103 KBE/ml) vorbehandelt, dann wurden 200 μM H2O2 zugegeben und zusammen 4 Stunden lang inkubiert . Abschließend wurden der MTT-Assay und die Überlebensrate nach Methode 5.5.1 berechnet.

Um die Schutzwirkung von mit Selen angereichertem C-1 auf durch H2O2 gestresste Caco-2-Zellen zu verifizieren, wurden die Transkription von zellinflammatorischen Zytokinen (IL-8, IL-1β und TNF-ɑ), die Gene des Membranpermeabilitätsproteins (Transmembranprotein-Gen Claudin -1, peripheres Membranprotein-Gen ZO-1, Occludin) wurden q-RT-PCR37 nachgewiesen. Die Zell-RNA-Extraktion und die relative mRNA-Expression von IL-8, IL-1β, TNF-α, ZO-1, Clautin-1 und Occludin wurden gemäß den Anweisungen der entsprechenden Kits (Sigma-Aldrich) bestimmt. GAPDH wurde als internes Referenzgen ausgewählt und die relativen mRNA-Expressionsniveaus wurden gemäß 2−ΔΔCT berechnet. Die verwendeten Primer sind in Tabelle S1 aufgeführt. Die unbehandelten Caco-2-Zellen dienten als Kontrolle und alle Tests wurden dreifach durchgeführt.

Die Transkriptomanalyse von RNA-seq wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt26. Kurz gesagt, die RNA wurde separat aus B. amyloliquefaciens C-1 extrahiert, das in LB + G-Medium mit 100 μg/ml Na2SeO3 im vegetativen Stadium (16–18 h) und im Sporulationsstadium (36 h) unter Verwendung eines Bakterien-RNA-Kits (Tiangen Biotech) gezüchtet wurde Co. Ltd, Peking, China). C-1, gezüchtet in LB + G-Medium ohne Na2SeO3, wurde als Negativkontrolle verwendet, die Kontrolle und die Behandlung erfolgten alle in dreifacher Ausfertigung. Es wurden insgesamt 3 μg RNA pro Probe verwendet. Sequenzierungsbibliotheken wurden mit dem NEBNext® UltraTM RNA Library Prep Kit für Illumina® (NEB, USA) gemäß den Empfehlungen des Herstellers erstellt und den Attributsequenzen jeder Probe Barcodes hinzugefügt. Die cDNA-Bibliothek wurde erstellt und die Transkriptomsequenzierung wurde bei Novogen Co. Ltd (Peking, China) durchgeführt. Die Rohdaten durchliefen die Qualitätskontrolle und wurden auf das Referenzgenom von C-1 (SRP127533) abgebildet, eine differenzielle Expressionsanalyse des vegetativen Stadiums (selenangereichertes C-1 vs. C-1), des Sporulationsstadiums (selenangereichertes C-1 vs . C-1) wurde mit dem DESeq R-Paket (v1.18.0) durchgeführt. Die resultierenden P-Werte wurden unter Verwendung des Benjamini- und Hochberg-Ansatzes zur Steuerung der Falscherkennungsrate (FDR) angepasst. Gene mit einem angepassten P-Wert <0,05, der durch DESeq gefunden wurde, wurden als differenziell exprimiert zugeordnet. Als Schwelle für eine signifikant unterschiedliche Expression wurden ein FDR von 0,005 und ein log2 (Fold Change) von 1 festgelegt. Für die unterschiedlich exprimierten Gene wurden die GO- (Gene Ontology) und KEGG- (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) Anreicherungen analysiert38.

Zur Validierung der RNA-seq-Analysedaten wurde q-RT-PCR verwendet, um die Genexpressionsniveaus von B. amyloliquefaciens C-1-Zellen mit und ohne Se-Anreicherung unter denselben Bedingungen zu quantifizieren, die für die RNA-seq-Analyse verwendet wurden. Anschließend wurden die reverse Transkription und die quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion gemäß den Methoden in 2.6.4 durchgeführt. Als interne Referenz wurde 16S-rRNA verwendet. Drei Gene wurden zufällig ausgewählt und die Detailinformationen der Primer für die ausgewählten Gene sind alle in Tabelle S1 aufgeführt.

Alle experimentellen Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt und mit SPSS 22.0 (IBM Inc., IL, USA) statistisch analysiert. Die statistische Signifikanz wurde durch eine einfache ANOVA berechnet und die Unterschiede waren bei P < 0,05 signifikant. Und GraphPad Prism 7 wurde für die grafische Darstellung und Analyse verwendet.

Die in dieser Studie enthaltenen Daten sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor ([email protected]) erhältlich.

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Wir schätzen die Unterstützung und Unterstützung des Instrumental Analysis Center der Xi'an Jiaotong University sehr.

Diese Forschung wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82173526) finanziert; Wichtiges Forschungs- und Entwicklungsprogramm der Provinz Shaanxi (Nr. 2022ZDLNY01-10).

School of Public Health, Health Science Center, Xi'an Jiaotong University, Xi'an, 710061, Shaanxi, China

Jin Liu, Lu Shi, Xinxin Ma, Sijin Jiang, Xinyao Hou, Pu Li, Yue Cheng, Jia Lv, Shaoru Li, Tianyou Ma und Bei Han

Schlüssellabor für Krankheitsprävention und -kontrolle und Gesundheitsförderung der Provinz Shaanxi, Xi'an, 710061, Shaanxi, China

Yue Cheng, Jia Lv, Shaoru Li, Tianyou Ma und Bei Han

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Konzeptualisierung, JL, TYM und BH; Methodik, JL und LS; Software, YC; Validierung, XXM, SJJ und XYH; formale Analyse, JL und LS; Ressourcen, BH.; Datenkuration, PL; Schreiben-Original-Entwurfsvorbereitung, JL; Schreiben, Rezensieren und Lektorieren, TYM und BH; Visualisierung, J.Lv. und SRL; Aufsicht, BH; Projektverwaltung, J.Lv. und SRL; Finanzierungseinwerbung, BH Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und sind damit einverstanden.

Korrespondenz mit Tianyou Ma oder Bei Han.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Liu, J., Shi, L., Ma, X. et al. Charakterisierung und entzündungshemmende Wirkung des mit Selen angereicherten Probiotikums Bacillus amyloliquefaciens C-1, einem potenziellen Postbiotikum. Sci Rep 13, 14302 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40988-8

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Eingegangen: 22. Mai 2023

Angenommen: 19. August 2023

Veröffentlicht: 31. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40988-8

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