Funktionelle Anmerkungen und vergleichende Genomanalysen von Balamuthia mandrillaris zeigen potenzielle Virulenz

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 14318 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Balamuthia mandrillaris ist ein pathogenes Protozoon, das eine seltene, aber fast immer tödliche Infektion des Zentralnervensystems und in einigen Fällen Hautläsionen verursacht. Derzeit umfassen die Genomdaten dieser frei lebenden Amöbe die Beschreibung mehrerer vollständiger mitochondrialer Genome. Im Gegensatz dazu sind in GenBank zwei vollständige Genome in Entwurfsqualität verfügbar, von denen jedoch keines über eine funktionale Annotation verfügt. In der vorliegenden Studie wurde das vollständige Genom von B. mandrillaris, das aus einer künstlichen Süßwasserlagune isoliert wurde, sequenziert und zusammengesetzt, wodurch ein zusammengesetztes Genom mit besseren Parameterwerten für die Assemblierungsqualität als die derzeit verfügbaren Genome erhalten wurde. Anschließend wurde das zuvor erwähnte Genom zusammen mit den Stämmen V039 und 2046 einer funktionellen Annotation unterzogen. Schließlich wurde eine vergleichende Genomanalyse durchgeführt und es wurde festgestellt, dass homologe Gene im Kerngenom möglicherweise an der Virulenz von Acanthamoeba spp. beteiligt sind. und Trypanosoma cruzi. Darüber hinaus wurden elf von fünfzehn Genen in den drei beschriebenen Stämmen als potenzielle Zielgene für die Entwicklung neuer Behandlungsansätze für B. mandrillaris-Infektionen identifiziert. Diese Ergebnisse beschreiben Proteine im gesamten Genom dieses Protozoen und helfen bei der Priorisierung, welche Zielgene für die Entwicklung neuer Behandlungen verwendet werden könnten.

Balamuthia mandrillaris ist eine frei lebende Amöbe (FLA), die in der Umwelt wärmerer Länder weit verbreitet ist1. Es ist der Erreger einer chronischen Infektion namens Balamuthia-Amöbenenzephalitis (BAE), und in einigen Fällen gehen Hautläsionen einer Infektion des Zentralnervensystems (ZNS) voraus2. Darüber hinaus wurde berichtet, dass diese Infektion immunkompetente und immungeschwächte Menschen betrifft, und derzeit wurden weltweit mehr als 200 Fälle mit einer Sterblichkeitsrate von > 90 % gemeldet, wobei die meisten dieser Fälle in den Vereinigten Staaten und Südamerika auftraten3. Diese hohe Sterblichkeitsrate ist in erster Linie auf die Schwierigkeit zurückzuführen, eine frühzeitige Diagnose zu erhalten (wenn die Krankheit möglicherweise beherrschbar ist), gepaart mit dem Mangel an spezifischen Medikamenten gegen B. mandrillaris-Infektionen; Die derzeitige Behandlung besteht aus einer Kombination antimikrobieller Mittel, die größtenteils empirisch ausgewählt werden, was derzeit zu wenigen Überlebensfällen führt4. Aus diesem Grund ist es notwendig, Techniken zu implementieren, die Omic-Wissenschaften in die Untersuchung dieses FLA einbeziehen, um bekannte Proteindomänen für den Fortschritt zur funktionellen Annotation zu identifizieren und Werkzeuge für das Wissen über die Pathogenomik dieses Protozoen bereitzustellen5.

Derzeit sind die genomischen Informationen dieses Mikroorganismus rar und nur die mitochondrialen Genome verschiedener Isolate wurden mit Anmerkungen versehen, mit Längen zwischen 39,8 und 42,8 Kb, 2 ribosomalen RNAs (rRNAs), 13 bis 18 Transfer-RNAs (tRNAs) und 33 auf 38 proteinkodierende Sequenzen4, 6. In einer aktuellen Studie wurde das B. mandrillaris-Transkriptom analysiert, etwa 40 % der vorhergesagten Proteine funktionell annotiert und 15 Zielgene für neue Behandlungsansätze für B. mandrillaris-Infektionen identifiziert7. Allerdings gibt es in der GenBank kein vollständig kommentiertes Genom dieser FLA, und für die Stämme 2046 und V039 sind nur zwei Entwurfsgenome in Qualität verfügbar, deren Größe jeweils zwischen 44 und 68 MB variiert8, 9.

In Bezug auf andere Mikroorganismen von medizinischer Relevanz wurde berichtet, dass Studien, die funktionelle Annotation und vergleichende Genomik kombinieren, Gene identifizieren, die mit Antibiotikaresistenz, Virulenzfaktoren, Transkriptionsregulatoren, Motilität und anderen zusammenhängen10,11,12,13. Die Pangenomanalyse von FLA ergab einzigartige Gene in pathogenen Acanthamoeba- und Naegleria fowleri-Arten. Für Acanthamoeba wurden Gene, die an der Virulenz beteiligt sind, als Metalloproteasen, Laminin-bindende Proteine und Hitzeschockproteine beschrieben14. Für Naegleria fowleri wurden Gene identifiziert, die mit Autophagie, Zytoskelett- und Membrandynamik, Motilität, Sekretionsprodukten, Reaktion auf Stress und posttranslationalen Modifikationen zusammenhängen15.

Der Mangel an genomischen Informationen hat die Entwicklung neuer Wirkstoffe gegen B. mandrillaris behindert. Daher könnte die Kombination von funktioneller Annotation und vergleichender Genomik dieses pathogenen Protozoen dabei helfen, die Genombiologie zu verstehen und konservierte Gene zwischen verschiedenen Stämmen zu identifizieren7, 16, 17. Diese Studie präsentiert die Annotation der Entwurfsgenome von B. mandrillaris in GenBank, die Genomassemblierung und Annotation eines in einer künstlichen Lagune isolierten Stammes und vergleichende Genomik der verschiedenen Stämme.

Der B. mandrillaris-Stamm ITSON01 wurde 2014 aus einer künstlichen Lagune in Ciudad Obregon, Mexiko, isoliert18. Trophozoiten wurden axenisch mit Balamuthia mandrillaris ITSON-Medium in belüfteten 75-cm2-Zellkulturflaschen bei 37 °C kultiviert19. Trophozoiten wurden zur DNA-Extraktion geerntet.

Trophozoiten wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) unter Verwendung von 6 Zellkulturflaschen mit 75 cm2 (ungefähr 10,8 × 106 Zellen) resuspendiert. Die DNA-Extraktion wurde unter Verwendung des Wizard SV Genomic DNA Purification System (Promega, Madison, WI) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt, wobei 0,46 µg Gesamt-DNA erhalten wurden. Die Bibliotheken wurden dann im Genomic Services Laboratory (LABSERGEN, Irapuato, Gto) unter Verwendung der Illumina NextSeq-Plattform mit 150 bp Paired-End-Reads sequenziert, was etwa 50 Millionen Reads ergab.

Darüber hinaus wurde die DNA-Extraktion für die Sequenzierung mit Oxford Nanopore Technologies (ONT) durchgeführt, indem Trophozoiten wie zuvor beschrieben mit PBS-Waschmitteln geerntet wurden, und es wurden insgesamt 20 Zellkulturflaschen mit 75 cm2 (ungefähr 36 × 106 Zellen) verwendet. Anschließend wurde die Extraktion mit dem Wizard HMW DNA Extraction Kit (Promega, Madison, WI) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt, wobei 6,89 µg Gesamt-DNA erhalten wurden. Die Bibliotheken wurden dann bei der Firma Health GeneTech (HGT, Taoyuan, TW) mit der ONT-gridION-Plattform sequenziert, was insgesamt etwa 3 Millionen Lesevorgänge (8,5 GB Gesamtbasen) ergab. Die Längenverteilung der rohen langen ONT-Lesevorgänge wurde mit NanoPlot v1.41.020 aufgezeichnet.

Der Zusammenbau des mitochondrialen Genoms (mtDNA) von B. mandrillaris wurde nur mit kurzen Lesevorgängen (Illumina) durchgeführt. Rohlesevorgänge wurden mit Standardparametern für Qualität und Mindestlänge mit Trim Galore v0.6.421 gefiltert und de novo mit SPAdes v3.1322 zusammengestellt. Sobald die Anordnung erhalten war, wurde zur Identifizierung der mtDNA die Syntenie durch Abgleich mit 8 vollständigen mtDNA (GenBank-Zugangsnummer: KT175738, KT175739, KT030672, KT175740, KT030671, KT030673, KT175741 und KT030670) unter Verwendung von Mauve23 definiert. Anschließend wurde das oben genannte mitochondriale Genom isoliert und die Annotation von tRNA und proteinkodierenden Genen (CDS) mit GeSeq24 durchgeführt, während die rRNAs mit barrnap v0.925 identifiziert wurden. Schließlich wurden die rRNAs durch manuelle Kuration mit Artemis26 an die GeSeq-Ausgabedatei angehängt. Ein Vergleich der ITSON01-mtDNA wurde mit den 8 oben genannten Genomen und einem kürzlich veröffentlichten Genom (GenBank-Zugangsnummer: OM994889) unter Verwendung des CGview Compare Tool (CCT)27 durchgeführt.

Die langen ONT-Rohlesevorgänge wurden einer Adapterentfernung mit Porechop v0.2.428 und einer Qualitätsfilterung mit Filtlong v0.2.029 unterzogen, wodurch Lesevorgänge mit Längen von weniger als 1 kb eliminiert und die Phred-Qualitätswerte der ONT-Lesevorgänge ignoriert und die Qualität stattdessen mithilfe von K beurteilt wurde -mer stimmt mit der kurzen Illumina-Lese 30,31,32 überein. Die Hybridmontage wurde mit Standardparametern unter Verwendung von MaSuRCA v4.0.533 durchgeführt, wobei die rohen kurzen Illumina-Reads und gefilterten langen ONT-Reads als Eingabe verwendet wurden. Das Genom des B. mandrillaris-Stammes 2046 wurde ebenfalls unter Verwendung der verfügbaren Reads (GenBank-Zugangsnummern: SRR8980854, SRR8980855 und SRR8980856) für diesen Stamm neu zusammengesetzt und mit MaSuRCA v4.0.98 zusammengesetzt.

Die RNA-Extraktion für Poly(A) und die Gesamt-RNA-Sequenzierung wurden mit einem RNeasy Minikit (QIAGEN, Hilden, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt (nur die Extraktionstemperatur bei 4 °C und die Zentrifugationszeit wurden von 15 s auf 1 min geändert). Die RNA-Integrität wurde mit dem 2100 Bioanalyzer System (Agilent, Santa Clara, CA) bestimmt. Die Poly(A)-Bibliotheken wurden bei LC Sciences (Houston, TX) auf einer Illumina NovaSeq-Plattform mit 150 bp Paired-End-Reads sequenziert, was etwa 40 Millionen Reads pro Bibliothek ergab. Darüber hinaus wurde die gesamte RNA-Bibliothek auf demselben Unternehmen und auf derselben Plattform sequenziert, mit 150 bp Paired-End-Reads und einer Sequenzierungstiefe von etwa 200 Millionen Reads.

Die vollständigen Genome der drei Stämme wurden einer Genvorhersage und Annotation mit Funannotate v1.8.1434 unterzogen, wobei als Eingabe die Genomassemblierung jedes Stamms und die RNA-Seq-Reads verwendet wurden. Pannzer235 wurde verwendet, wenn Funannotate keine funktionale Beschreibung mit den folgenden Parametereinstellungen zuweisen konnte: minimale Abfrageabdeckung 0,4 oder minimale sbjct-Abdeckung 0,4 und minimale Alignment-Länge 50, um die annotierten Proteine und tRNA zu erhalten36, 37. Anschließend wurden die rRNAs (28S, 18S , und 5S) und lange nichtkodierende RNAs (lncRNAs) wurden anhand der Genomanordnung jedes Stammes als Eingabe mit StructRNAfinder38 vorhergesagt, wobei die Position in der Anordnung und Struktur dieser nichtproteinkodierenden RNAs als Ausgabe ermittelt wurde. Sobald diese nichtproteinkodierenden Gene erhalten wurden, wurde eine manuelle Kuration mit Geneious Prime v2023.0.439 durchgeführt. Schließlich wurden Begriffe der Genontologie (GO) aus den Funannotate-Ergebnissen extrahiert und auf WEGO 2.040 visualisiert.

Eine vergleichende Genomanalyse wurde unter Verwendung annotierter Proteinsequenzen der drei B. mandrillaris-Stämme (ITSON01, CDC-V039 und 2046) mit Standardparametern unter Verwendung von GET_HOMOLOGUES41, 42 durchgeführt, wobei der zum Pan/Core-Genom gehörende Sequenzcluster als Ausgabedatei erhalten wurde.

Nach der Filterung mit Trim Galore wurden etwa 0,18 % der Illumina-Reads entfernt, was einer Reduzierung von 50.109.114 auf 50.020.496 Reads entspricht. Die geringe Anzahl entfernter Lesevorgänge ist auf die hohe Qualität und Tiefenabdeckung der Sequenzen der Illumina-Plattformen zurückzuführen43. Bei den ONT-Lesevorgängen wurden nach Adaptertrimmung mit Porechop und Qualitätsfilterung mit den Illumina-Lesevorgängen als Referenz mit Filtlong etwa 43,74 % der Lesevorgänge entfernt, was einem Rückgang von 3.095.072 auf 1.741.403 Lesevorgänge entspricht, möglicherweise aufgrund der großen Anzahl von Lesevorgängen, die kleiner als 1 sind kb (Abb. 1). Der Großteil der gesamten Basen wurde jedoch zurückgehalten, sodass nach dem Filtervorgang etwa 11 % eliminiert wurden.

Längenverteilung der rohen langen ONT-Lesevorgänge.

Nach dem Zusammenbau und der Annotation wurde mtDNA mit einer Länge von 41.385 bp, 13 tRNA-, 37 CDS- und 2 rRNA-Untereinheiten erhalten. Die mtDNA des B. mandrillaris-Stamms ITSON01 wurde mit einigen mtDNA verschiedener in der GenBank verfügbarer Stämme verglichen. Dabei zeigte sich, dass die meisten mit Ausnahme der Stämme V451 und KM-20 einen identischen Prozentsatz von > 98 % aufweisen (Abb. 2).

Vergleich der mtDNA von B. mandrillaris mit der mtDNA verschiedener Stämme (von der Kante zur Mitte sind die Stämme V118, GAM19, RP5, 2046, OK1, SAM, V039, V451 und KM-20).

Nach der Hybridassemblierung des B. mandrillaris-Stamms ITSON01 wurde ein Genom von etwa 65 MB mit besseren Assemblierungsqualitätswerten wie der Anzahl der Contigs, N50, L50 und einem geringen Anteil an „N“ im Genom als derzeit erhalten verfügbar. Stattdessen führte die Reassemblierung des Genoms des B. mandrillaris-Stammes 2046 zu einem weniger fragmentierten Genom, einer größeren Genomgröße und einem niedrigeren „N“ als das aktuelle Genom dieses Stamms (Tabelle 1)8, 9. Diese Reassemblierung wurde für funktionelle und vergleichende Zwecke verwendet genomische Annotation.

Für den ITSON01-Stamm wurden 67 % seiner Gene als Proteine mit Funktionsbeschreibungen, 31 % als Proteine ohne Funktionsbeschreibung (hypothetische Proteine) und 2 % als nichtkodierende Gene (rRNA und tRNA) annotiert. Im Fall des V039-Stammes wurden 63 % seiner Gene als Proteine mit funktioneller Beschreibung identifiziert, 35 % als hypothetische Proteine und 2 % als rRNA und tRNA. Schließlich wurden für den Stamm 2046 63 % seiner Gene als Proteine mit funktioneller Beschreibung beschrieben, 35 % als hypothetische Proteine und 2 % als tRNA.

Es ist zu beachten, dass im Fall des Stamms 2046 aufgrund der hohen Fragmentierung des Genoms keine vollständigen ribosomalen RNAs annotiert werden konnten. Eine detaillierte Zusammenfassung der Annotationsergebnisse für jeden Stamm von B. mandrillaris ist in Tabelle 2 dargestellt. Was lncRNAs betrifft, wurden im Stamm ITSON01 zwei als MESTIT1, eine als NPPA-AS1 und eine als TCL6 annotiert, während im Stamm V039 zwei annotiert wurden Drei davon wurden als CDKN2B-AS, NPPA-AS1 und Six3os1 bezeichnet.

Was die Längenverteilung der rRNA-Strukturen betrifft, variierte im ITSON01-Stamm die große Untereinheit (LSU) von 3625 bis 5239 bp und die kleine Untereinheit (SSU) variierte von 2017 bis 2022 bp. Beim V039-Stamm variierte die LSU zwischen 3487 und 3853 bp und die SSU zwischen 2010 und 2028 bp. Darüber hinaus betrug die Länge der 5S-rRNA in beiden Stämmen 119 bp. Einige Beispiele für Strukturen einer solchen rRNA, die mit StructRNAfinder erhalten wurden, sind unten aufgeführt (Abb. 3).

Mit StructRNAfinder (erstellt mit BioRender.com) erhaltene rRNA-Strukturen.

Der GO-Term-Annotationsvergleich ergab ein ähnliches Profil für die drei Stämme, mit Ausnahme einiger kleinerer Genfamilien, die weniger als 0,1 % der Gene ausmachten (Abb. 4). Diese Analyse ergab auch, dass die GO-Begriffe mit der höchsten Repräsentation in der Kategorie biologischer Prozesse „zellulärer Prozess“ (GO: 0009987) und „Stoffwechselprozess“ (GO: 0008152) waren; für die Kategorie der Zellkomponenten waren es „Zelle“ (GO: 0005623) und „Zellteil“ (GO: 0044464); und schließlich waren es für die Kategorie der molekularen Funktionen „katalytische Aktivität“ (GO: 0003824) und „Bindung“ (GO: 0005488).

GO-Annotationen der Stufe 2, Proteine von B. mandrillaris 2046 (grün), B. mandrillaris ITSON01 (gelb) und B. mandrillaris V039 (blau), Prozentsätze der Gene und Gesamtzahl der Gene im logarithmischen Maßstab (10).

Die Ergebnisse der vergleichenden Genomanalyse wurden in einem Venn-Diagramm (Abb. 5) ausgedrückt, das die Überlappung zwischen orthologen Gruppen der verschiedenen Stämme von B. mandrillaris zeigt. Es ist zu beachten, dass die orthologen Gencluster des Kerngenoms etwa 6 % der Proteine jedes Stamms ausmachen. Gleichzeitig betrug die Anzahl der einzigartigen Proteingene, einschließlich der Paralogs jedes Stamms, 4123 (13,8 % der Gesamtproteine), 6357 (22 % der Gesamtproteine) und 9732 (33 % der Gesamtproteine). für die Stämme ITSON01, V039 bzw. 2046.

Venn-Diagramm der Überlappung zwischen orthologen Gruppen in den Proteomen verschiedener B. mandrillaris-Stämme.

Frühere Studien haben die verschiedenen Variationen in den mitochondrialen Genomen von B. mandrillaris beschrieben, darunter die Position einer Endonuklease mit offenem Leserahmen (ORF), die die Sequenz LAGLIDADG enthält; beim Stamm V039 ist dieser im Genom nicht vorhanden. In den Stämmen 2046, OK1, RP-5, SAM und KM-20 stört diese Sequenz das cox1-Gen, während sie in den Stämmen V451, GAM-19, V188 und ITSON01 in das ribosomale 23S-Gen eingefügt wird. Obwohl für eine mögliche Genotypisierung von B. mandrillaris mehr mitochondriale Genome erforderlich sind, könnte der Beitrag des mitochondrialen Genoms des Stammes ITSON01 dazu beitragen, dies in Zukunft zu erreichen5.

Die im ITSON01-Stamm im Vergleich zu früheren Arbeiten beobachteten besseren Assemblierungsmetriken des Kerngenoms sind hauptsächlich auf die Verwendung sowohl kurzer als auch langer Lesevorgänge (Illumina und ONT) sowie auf die Verwendung der MaSuRCA-Software zurückzuführen, die für die Assemblierung entwickelt wurde großer Genome und wurde dadurch charakterisiert, dass sie die besten Qualitätsparameter für die Hybridassemblierung in verschiedenen eukaryotischen Genomen erhalten44,45,46. Im Gegensatz dazu verbesserte sich der Genom-Zusammenbau des Stammes 2046 durch den Einsatz von MaSuRCA im Vergleich zum ursprünglichen Zusammenbau erheblich; Dies liegt möglicherweise daran, dass dieses Programm nachweislich bessere N50-Längenwerte als SPAdes erzielt und daher mit diesem Programm eine geringere Fragmentierung in den zusammengesetzten Genomen aufweist47. Darüber hinaus wurde die Reassemblierung im Vergleich zu den Genomen der anderen Stämme (ITSON01 und V039) nicht verbessert, da nur kurze Lesevorgänge verwendet wurden; Es ist bekannt, dass die Verwendung nur kurzer Lesevorgänge in eukaryotischen Genomassemblierungen zu einer höheren Fragmentierung (mehr Gerüste) führt48.

Durch die Verwendung von zwei Programmen, Funannotate und Pannzer2, wurde eine größere Anzahl von Genen mit annotierten Funktionsbeschreibungen erhalten. Funannotate verwendet verschiedene kuratierte Datenbanken, um funktionale Annotationen durchzuführen, wie PFAM, InterPro, MEROPS und CAZy, und um Gennamen und Beschreibungen mit EggNOG und UniProtKb/SwissProt zu bestimmen, wobei letzteres aus manuell überprüften, hochwertigen Proteinsequenzen besteht (ca. 0,5 Millionen). Sequenzen). Darüber hinaus verwendet Pannzer2 zwei UniProtKb-Datenbanken, SwissProt und TrEMBL, wobei letztere aus rechnerisch überprüften Proteinsequenzen hoher Qualität besteht (ungefähr 208 Millionen Sequenzen). Daher war die große Anzahl der herangezogenen Sequenzen eine große Hilfe für die Annotation der funktionellen Homologie des B. mandrillaris-Genoms49,50,51.

Dem Venn-Diagramm zufolge verfügt der Stamm 2046 über eine höhere Anzahl einzigartiger Proteine als die anderen Stämme, was daran liegen könnte, dass die Fragmentierung des Genoms mit der Duplikation spezifischer Sequenzen innerhalb des zusammengesetzten Genoms korreliert sein kann52. Im Wolkengenom des Stammes ITSON01 wurden mehrere paraloge Gene identifiziert, die für Protease (ohne Gruppenklassifizierung) und das Vps9-Domänen enthaltende Protein kodieren. Letzteres wurde in anderen FLAs von medizinischer Bedeutung wie Naegleria fowleri5 gefunden. Inzwischen wurden innerhalb der orthologen Gruppen des Kerngenoms der drei Stämme homologe Gene identifiziert, die möglicherweise an der Wirtsinvasion pathogener Akanthamöbenarten beteiligt sind, nämlich SH3-Domänen enthaltendes Protein, Filamin-Wiederholungsdomänen-haltiges Protein, Myosin-II-Leichtkette 1, Myosin IA, Hitzeschockprotein 20, Superoxiddismutase, Metacaspase und RAP7; Die ersten 4 Gene stehen im Zusammenhang mit dem Zytoskelett, der Fähigkeit, hohe Temperaturen zu tolerieren, der Abwehr reaktiver Sauerstoffspezies, dem Phagozytoseprozess und der endosomalen Abgabe nach der Phagozytose (dominiert die Energieproduktion und das Zellwachstum) (Ergänzungstabelle S1)14, 53. Darüber hinaus Homologie wurde auch für eine Cysteinprotease namens Cruzipain aus dem pathogenen Protozoen Trypanosoma cruzi gefunden, die in diesem Protozoen wichtige Funktionen wie die Umgehung der Immunantwort, die Differenzierung, den Stoffwechsel und die Invasion von Wirtszellen übernimmt54. Daher ist es wahrscheinlich, dass diese oben genannten Gene an ähnlichen molekularen Signalwegen beteiligt sind und daher in B. mandrillaris die gleichen molekularen Funktionen haben.

Auf andere Weise haben wir beobachtet, dass innerhalb der drei Stämme insgesamt 11 der zuvor veröffentlichten 15 Sequenzen identifiziert wurden, die für die Kodierung von Zielproteinen für die Entwicklung neuer Behandlungen für B. mandrillaris-Infektionen verantwortlich sind, nämlich Methionyl-tRNA-Synthetase, Xylose-Isomerase, Hitzeschockprotein 90, Lanosterol-14-alpha-Demethylase, Histon-Deacetylase, 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym-A-Reduktase, zwei Arten von DNA-Topoisomerase, Calcium-ATPase, Glucokinase und Exportin-17. Darüber hinaus wurden in allen drei Stämmen kodierende Sequenzen für Enzyme gefunden, die die Zerstörung und Migration durch den Wirt erleichtern, wie z. B. Metalloproteinasen, Phospholipase A2 und Phospholipase D4.

In der vorliegenden Studie wurde eine Homologie mit Acanthamoeba castellanii im Kerngenom eines Gens gefunden, das für eine Serincarboxypeptidase kodiert. Dieser Enzymtyp wurde in silico als pharmakologisches Ziel bei durch N. fowleri verursachten Infektionen beschrieben, da er mit der Virulenz dieses Protozoen zusammenhängt, wie durch genomische und transkriptomische Studien nachgewiesen wurde. In ihrer Schlussfolgerung schlugen sie vor, dass dieses Enzym über eine Ligandenbindungsstelle verfügt, die sich für ein Design basierend auf der Struktur spezifischer Inhibitoren eignet, und postulierten, dass es ein zuverlässiges Ziel für die Behandlung der primären amöbischen Meningoenzephalitis (PAM) mit Arzneimitteln sei, die speziell auf die Blockierung der Proliferation durch Hemmung der molekularen Funktion abzielen55 .

Bezüglich des Schalengenoms (ITSON01-V039) wurde festgestellt, dass eine extrazelluläre Protein-Aminopeptidase-Familie M20/M25/M40 mit derselben pathogenen Art von Akanthamöben homolog ist. Es wurde gezeigt, dass dieses Enzym am Pathogeneseprozess von Acanthamoeba beteiligt ist, indem die von dieser FLA sezernierten Proteine mit einem Leucin-Aminopeptidase-Inhibitor oder einem spezifischen Antibiotikum gegen das oben genannte Enzym vorbehandelt wurden, und es wurde eine Verringerung der zellbasierten Assay-Schäden beobachtet56. Im Gegensatz zu den anderen pathogenen FLA-Arten wurden apathogene Arten der Gattung Balamuthia bisher nicht beschrieben. Kürzlich wurde über eine neue Art dieser Gattung berichtet (Balamuthia spinosa); Es ist jedoch noch nicht beschrieben, ob es beim Menschen pathogen ist57. Daher fehlt immer noch eine Analyse der differentiellen Expression, um zu bestimmen, welche Proteine an der Pathogenese von B. mandrillaris beteiligt sind. Basierend auf den vorgelegten Beweisen könnten die Proteine jedoch, wie bereits erwähnt, mit den Mechanismen dieses pathogenen Protozoen in Zusammenhang stehen.

Im Hinblick auf die Behandlungsentwicklung gegen B. mandrillaris wurde in einer kürzlich durchgeführten Studie festgestellt, dass Formulierungen aus Azol (Fluconazol und Itraconazol) und 5-Nitroimidazol (Metronidazol) eine beträchtliche antiparasitäre Wirkung gegen N. fowleri und B. mandrillaris Amöben hatten, die jedoch begrenzt war zytotoxische Schäden in menschlichen Zellen und Verringerung des durch den Krankheitserreger verursachten Zelltods des Wirts58. In der vorliegenden Studie fanden wir Homologie mit Bakterien und Archaeen (Heimdallarchaeota) im Kerngenom und in den Shell-Genen (ITSON01-V039), die für Nitroreduktasen kodieren. Diese Enzyme sind wichtig für die Wirksamkeit von antimikrobiellen Mitteln wie Metronidazol, das eine Reduzierung seiner Nitrogruppe erfordert, um antimikrobielle Wirkung zu zeigen59. Homologie wurde auch mit dem FLA A. castellanii in den Kerngenomgenen gefunden, die für Lanosterol-14-alpha-Demethylase kodieren, das als Ziel bei der Behandlung mit Azolen beschrieben wurde60.

Ein weiterer interessanter Befund ist die Identifizierung von lncRNAs im Genom von B. mandrillaris. Es hat sich gezeigt, dass dieser Typ nichtkodierender RNA durch seine Regulierung der Genexpression an der Entwicklung und an physiologischen Prozessen beteiligt ist61. Eine der von den Stämmen ITSON01 und V039 gemeinsam genutzten lncRNAs war NPPA-AS1. In früheren Studien wurde ein Anstieg dieser Art von lncRNA in HCT-8-Zellen beobachtet, die mit dem pathogenen Protozoon Cryptosporidium parvum infiziert waren, was darauf hindeutet, dass diese lncRNA unter anderem an der Infektion mit diesem Mikroorganismus beteiligt sein könnte62. Von den anderen identifizierten lncRNAs ist noch keine Funktion im Zusammenhang mit Infektionskrankheiten bekannt. Ein zu beachtender Aspekt ist, dass viralen lncRNAs im Vergleich zu viralen Proteinen auch die Fähigkeit zugeschrieben wird, keine Immunantwort auszulösen, was darauf hindeutet, dass Viren sie als weitere Strategie nutzen könnten, um in ihre Wirte einzudringen61. Daher ist es ein wünschenswertes Untersuchungsgebiet für pathogene Amöben und andere Mikroorganismen, die Infektionen hervorrufen können.

In der vorliegenden Studie wurde eine Annotation der nuklearen und mitochondrialen Genome von B. mandrillaris erreicht und wertvolle Informationen über mögliche Gene gewonnen, die an der Pathogenität dieses Protozoen durch Homologe mit anderen pathogenen Protozoenarten beteiligt sind. Es fehlen jedoch noch Studien zur funktionellen Genomik zur Bestimmung von Genen, die mit der Virulenz dieser FLA zusammenhängen. Darüber hinaus trug die in dieser Studie durchgeführte vergleichende Genomik verschiedener Stämme dazu bei, die Homologie zwischen Zielgenstämmen für eine mögliche Behandlung gegen B. mandrillaris-Infektionen zu identifizieren, was bei der Priorisierung der Entwicklung von Behandlungen für die vorgestellten Zielsequenzen hilfreich sein könnte.

Die in dieser Studie präsentierten Datensätze können in Online-Repositories gefunden werden. Die Repository-Namen und Zugangsnummern finden Sie unter dem BioProject: PRJNA975899 (https://dataview.ncbi.nlm.nih.gov/object/PRJNA975899?reviewer=slsojv2t5rc6q14qgbarhgnlp0).

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Wir danken der CIIDIR-IPN Sinaloa Unit für die Unterstützung des Ooream-Clusters bei der Durchführung bioinformatischer Analysen. Die Autoren danken dem Postgraduiertenstipendienprogramm des National Council of Humanities, Science and Technology (CONAHCYT), dem Cátedras-CONAHCYT-Programm und dem Technological Institute of Sonora.

Dieser Artikel wurde vom National Council for the Humanities, Science and Technology (Grant-Nr. 840834), Programm zur Förderung und Unterstützung von Forschungsprojekten (Grant-Nr. PROFAPI_2023_118) finanziert.

Doktorandenprogramm in Naturwissenschaften mit Spezialisierung auf Biotechnologie, Abteilung für Biotechnologie und Lebensmittelwissenschaften, Technologisches Institut von Sonora, 85000, Ciudad Obregón, Sonora, Mexiko

Alejandro Otero-Ruiz

CONAHCYT-Technologisches Institut von Sonora, 85000, Ciudad Obregón, Sonora, Mexiko

Libia Zulema Rodriguez-Anaya & Jose Reyes Gonzalez-Galaviz

Abteilung für Agrar- und Veterinärwissenschaften, Technologisches Institut von Sonora, 85000, Ciudad Obregón, Sonora, Mexiko

Fernando Lares-Villa & Luis Fernando Lares-Jiménez

Abteilung für Bioinformatik-Analyse, Zentrum für Genomwissenschaften der Nationalen Autonomen Universität von Mexiko (UNAM), 62210, Cuernavaca, Morelos, Mexiko

Luis Fernando Lozano Aguirre Beltrán

CONAHCYT-National Polytechnic Institute, CIIDIR Sinaloa Unit, 81101, Guasave, Sinaloa, Mexiko

Abraham Cruz-Mendivil

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Gestaltung der Arbeit, LZRA; Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung, AOR; Überprüfung und Bearbeitung, LZRA, FLV, JRGG, ACM, LFLV, LFLAB; Interpretation von Daten, AOR, ACM, LFLAB; Projektverwaltung, LZRA, FLV; Finanzierungseinwerbung, LZRA Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und sind damit einverstanden.

Korrespondenz mit Libyen Zulema Rodriguez-Anaya.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Otero-Ruiz, A., Rodriguez-Anaya, LZ, Lares-Villa, F. et al. Funktionelle Annotation und vergleichende Genomanalyse von Balamuthia mandrillaris zeigen potenzielle Virulenz-bezogene Gene. Sci Rep 13, 14318 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41657-6

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Eingegangen: 20. Juni 2023

Angenommen: 29. August 2023

Veröffentlicht: 31. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41657-6

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