Ägyptische Mandarinenschalenöl wirkt anti

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 14192 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die aktuelle Studie untersuchte das scabizide Potenzial von ägyptischem Mandarinenschalenöl (Citrus reticulata Blanco, F. Rutaceae) gegen Sarcoptes-Räude bei Kaninchen. Bei der GC-MS-Analyse des Öls wurden insgesamt 20 Verbindungen identifiziert, was 98,91 % aller gefundenen Verbindungen ausmacht. Die topische Anwendung von Mandarinenschalenöl verbesserte alle Anzeichen einer Infektion und verursachte drei Tage später eine scabizide Wirkung, während die In-vitro-Anwendung einen Tag später zum vollständigen Absterben der Milben führte. Im Vergleich zu Ivermectin zeigte die histopathologische Analyse, dass die entzündliche Infiltration/Hyperkeratose der Epidermis verschwunden war. Zusätzlich zu TIMP-1 zeigten die Ergebnisse der mRNA-Genexpressionsanalyse eine Hochregulierung von I-CAM-1 und KGF und eine Herunterregulierung von ILs-1, 6, 10, VEGF, MMP-9 und MCP-1. Das Krätze-Netzwerk wurde aufgebaut und einer umfassenden bioinformatischen Auswertung unterzogen. TNF-, IL-1B und IL-6, die drei wichtigsten Hub-Protein-kodierenden Gene, wurden als wichtige therapeutische Ziele für Krätze identifiziert. Den molekularen Docking-Daten zufolge erlangten die Verbindungen 15 und 16 eine ausreichende Affinität zu den drei untersuchten Proteinen, insbesondere besaßen beide eine höhere Affinität zum IL-6-Rezeptor. Interessanterweise erreichte es einen höheren Bindungsenergiewert als der Ligand des angedockten Proteins, anstatt ordnungsgemäße Bindungswechselwirkungen wie die des Liganden aufzuweisen. Unterdessen zeigte Geraniol (15) die höchste Affinität zum GST-Protein, was darauf hindeutet, dass es zur akariziden Wirkung des Extrakts beiträgt. Die anschließenden MD-Simulationen zeigten, dass Geraniol eine stabile Bindung innerhalb der Bindungsstelle von GST und IL-6 erreichen kann. Unsere Ergebnisse zeigten erstmals die scabizide Wirkung von Mandarinenschalenextrakt und ebneten damit den Weg für eine effiziente, wirtschaftliche und umweltfreundliche pflanzliche Alternative zur Behandlung von Kaninchen mit Sarcoptes-Räude.

Sarkoptesräude (Sarcoptes scabiei) ist eine schwere Infektionskrankheit, die Menschen und Tiere auf der ganzen Welt befällt1. Die Milben sind als ansteckende, grabende und obligate Parasiten bestens an den Kontakt mit ihrem Wirt angepasst. Sarkoptesräude Die Produktion von Schweinezüchtern wird durch erwachsene weibliche Milben negativ beeinflusst; weil sie sich auf der Hautoberfläche paaren, sich in die Haut eingraben, Eier legen und Reizungen verursachen, die zu Blutungen, verminderter Nahrungsaufnahme und Entwicklung, chronischem Stress und vermindertem Wohlbefinden führen können2,3. Das klinische Bild stellt eine chronische Hyperkeratotik dar, die durch das Vorhandensein von Ohrkrusten und vielen Milben am Tier gekennzeichnet ist4. Ähnlich wie Menschen sind Kaninchen anfällig für eine Sarcoptes-Infektion oder Räude, was die Produktion verringert und zu wirtschaftlichen Verlusten für Kaninchen führt, insbesondere wenn keine wirksame Behandlung erfolgt5. Zu den Therapieoptionen gehören die systemische Behandlung mit makrozyklischen Lactonen, die lokale Verabreichung von Amitraz oder Pyrethroiden oder beides6,7. Trotz ihrer langjährigen Wirksamkeit bei der Behandlung von Räude hat ihr umfangreicher Einsatz aufgrund der Entstehung von Arzneimittelresistenzen zu einem Rückgang der Wirksamkeit geführt. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, neuartige Skabizide zu entwickeln, die sowohl effizient als auch sicher sind, um Krätze bei Säugetieren zu behandeln und zu kontrollieren6.

Bei Kaninchen, Ziegen und Schweinen wurden mehrere ätherische Öle aus Citrus limon, Lavandula angustifolia, Citrus aurantium amara, Pelargonium asperum, Melaleuca alternifolia, Syzygium aromaticum, Eucalyptus radiata, Leptospermum scoparium, Juniperus oxycedrus, Cryptomeria japonica und Cymbopogon martini eingesetzt zum Test in Echtzeit gegen S. scabiei8,9,10,11,12. Ätherische Öle werden in der Regel chemischen Akariziden vorgezogen, da sie für Tiere weniger schädlich sind und eine kürzere Umweltpersistenz haben. Außerdem ist bekannt, dass die komplexe Chemie ätherischer Öle die Entstehung von Arzneimittelresistenzen gegen diese Chemikalien erheblich erschwert13. Da ätherische Öle jedoch aus einer komplexen Mischung von Komponenten bestehen, kann es schwierig sein, die akariziden Eigenschaften eines ätherischen Öls einem bestimmten Inhaltsstoff oder einer bestimmten Kombination von Verbindungen zuzuschreiben14. Hautreizungen sind ein weiterer potenzieller Nachteil, über den beim Menschen berichtet wurde15.

Zu den begehrtesten Zitrusfrüchten für den Frischverzehr gehören Mandarinen, C. reticulata16. Der häufigere Name für sie ist „Mandarine“, gelegentlich werden sie aber auch „Mandarinen“ genannt. Die Mandarinenart umfasst eine Reihe von Sorten und Hybriden16. Zu den häufig angebauten Sorten gehören C. unshiu Marcovitch (auf Japanisch auch als Unshiu mikan bekannt), C. nobilis Loureiro (auch als Königsmandarinen bekannt), C. deliciosa Tenore (auch als Mittelmeermandarinen bekannt) und C. reticulata Blanco (Gewöhnliche Mandarinen). )16,17. Mandarinen sind eine der wichtigsten Zitrusfrüchte, die in vielen Ländern wie China, Brasilien, den USA, Indien, Mexiko, Spanien usw. angebaut werden. Die Früchte haben einen großen kommerziellen Wert für ihre ätherischen Öle und anderen Duftstoffe, auch wenn sie hauptsächlich verwendet werden Gebäck backen18. Viele Getränke, Süßigkeiten, Kekse und Desserts verwenden Zitrusaromen19, während die Schalen von C. reticulata zum Aromatisieren von Alkohol verwendet werden19. Citrus reticulata EO zeigte eine antiproliferative Aktivität gegen durch Bleomycin (BLM) verursachte Lungenfibrose bei Ratten und schützende Eigenschaften gegen humane embryonale Lungenfibroblasten (HELFs). Es wird angenommen, dass die Methode die Korrektur des Ungleichgewichts zwischen Oxidation und Antioxidation, die Verringerung der Kollagenablagerung und Fibrose sowie die Herunterregulierung der Lungengewebeexpression von Bindegewebswachstumsfaktor (CTGF) und mRNA20 beinhaltet. Aufgrund seiner hohen d-Limonen-Konzentration21 zeigte C. reticulata EO eine mäßige Radikalfängerwirkung22. Mandarinenöl ist bekannt für sein breites antibakterielles und antimykotisches Wirkungsspektrum. Es hemmt das Wachstum mehrerer Bakterien, darunter Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus22,23, sowie mehrerer Pilze, darunter Penicillium italicum, P. chrysogenum, P. digitatum, Aspergillus niger, -A. flavus, Alternaria alternata, Curvularia lunata, Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum und Helminthosporium oryzae23,24,25,26.

In der aktuellen Studie wurde die GC-MS-Profilierung von Mandarinenschalenöl verwendet. Darüber hinaus wurde zum ersten Mal durch In-vitro-, In-vivo-, Histopathologie-, mRNA-Expressions- und Netzwerk-/In-silico-Analyse das scabizide Potenzial des Extrakts gegen Sarcoptic-Räude bei Kaninchen untersucht und dabei Folgendes berücksichtigt: die Einbeziehung natürlicher Kandidaten für die ordnungsgemäße und sichere Behandlung von Infektionskrankheiten. Der Rahmen der vorliegenden Untersuchung ist in Abb. 1 dargestellt.

Allgemeiner Ablauf der Studie.

Pflanzenmaterialien und Experimente wurden in Übereinstimmung mit relevanten institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien durchgeführt. Die Studie fand gemäß der Genehmigungsnummer der Ethikkommission vom 05.09.2022 am Deraya College statt. Dies erfolgte in Übereinstimmung mit den Richtlinien des National Institute of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren und den ARRIVE-Richtlinien27.

Im Januar 2021 wurden C. reticulata-Kulturfrüchte in einem Hausgarten in der Atia-Straße in Beni-Suef, Ägypten, geerntet. Ein Belegexemplar (2021-BuPD-88) wurde bei der Pharmakognosie-Abteilung, Fakultät für Pharmazie, Beni-Suef-Universität, Ägypten, hinterlegt.

Mit dem Clevenger-Gerät wurden die frischen Schalen (0,5 kg) zwei Stunden lang bei 75 °C hydrodestilliert. Das Öl wurde gesammelt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Lagerung in luftdichten Braunglasfläschchen bei 4 °C aufbewahrt. Auf der Grundlage des Frischgewichts des Pflanzenmaterials wurde der Ertrag (V/G-%) berechnet28,29.

Mithilfe der Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC/MS) wurde eine chromatographische Analyse des aus den Schalen gewonnenen Öls durchgeführt28,30. Das GC-MS-Gerät kombiniert einen thermischen Massenspektrometer-Detektor (ISQ-Einzelquadrupol-Massenspektrometrie) mit einem TRACE GC-Ultrahochleistungs-Gaschromatographen (THERMO Scientific Corp., USA). Im GC-MS-System wurde eine TR-5-MS-Säule (30 m × 0,32 mm Innendurchmesser, 0,25 mm Filmdicke) installiert. Für die Analysen wurde Helium als Trägergas verwendet und das Aufteilungsverhältnis mit folgendem Temperaturprogramm auf 1:10 eingestellt: 60 °C für 1 Minute, gefolgt von 4,0 °C/min auf 240 °C und eine 1-minütige Temperaturregelung halten. Bei 210 °C wurden der Injektor und der Detektor gehalten. Ein-Liter-Proben der Mischungen wurden immer als verdünnte Proben verabreicht (1:10 Hexan, v/v). Durch Verwendung eines Spektralbereichs von m/z 40–450 und Elektronenionisation (EI) bei 70 eV wurden Massenspektren erstellt. Mithilfe der AMDIS-Software (www.amdis.net) wurden die chemischen Komponenten des ätherischen Öls entfaltet und anhand ihrer Retentionsindizes (relativ zu den n-Alkanen C8–C22), Massenspektren, die echten Standards entsprachen, und Retentionszeiten (sofern verfügbar) identifiziert ). (NIST Standard Reference Database, 78 Version 5.10) Wiley-Spektralbibliothekssammlung28,31,32.

Die Reaktion mit einer definierten Menge exogen bereitgestelltem Wasserstoffperoxid (H2O2) wurde zur Bestimmung der H2O2-Fängeraktivität verwendet, die die antioxidative Kapazität des Schalenöls widerspiegelt. Zur Schätzung des restlichen H2O233 wurde eine kolorimetrische Analyse verwendet. Kurz gesagt, 20 µl der Probe wurden mit 500 µl H2O2 gemischt und 10 Minuten bei 37 °C inkubiert. Dann wurden 500 l der Enzym/3,5-Dichlor-2-hydroxyl-benzolsulfonat-Lösung zugegeben und es wurde 5 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Intensität des gefärbten Produkts wurde kolorimetrisch bei 510 nm quantifiziert. Eine Positivkontrolle war Ascorbinsäure. Durch Vergleich der Testergebnisse mit denen der Kontrollgruppe wurde der Prozentsatz der H2O2-Fängeraktivität berechnet und die folgende Formel angewendet:

Der IC50-Wert jeder Probe wurde nach Durchführung des Assays bei acht verschiedenen Konzentrationen (1000, 750, 500, 375, 250, 187,5, 125 und 0 µg/ml) mit der Software Graph Pad Prism 7 berechnet.

Die Abfangaktivität des Superoxidanions wurde gemessen34. In einer Tris-HCL-Lösung (16 mM, pH 8,0) mit 90 l NBT (0,3 mM), 90 l NADH (0,936 mM), 0,1 ml Schalenöl (125, 250, 500 und 1000 g/ml) und 0,8 ml Tris-HCl-Puffer wurden Superoxidanionenradikale erzeugt (16 mM, pH 8,0). Nach Zugabe von 0,1 ml PMS-Lösung (0,12 mM) zur Mischung wurde die Reaktion gestartet. Anschließend wurde die Mischung 5 Minuten lang bei 25 °C inkubiert und während dieser Zeit die Absorption bei 560 nm gemessen. Als Modellsubstanz wurde Ascorbinsäure verwendet. Mithilfe der folgenden Formel wurde die prozentuale Hemmung durch Vergleich der Testergebnisse mit denen der Kontrolle berechnet:

IC50 wurde geschätzt, indem der Test bei vier verschiedenen Konzentrationen und mit der GraphPad Prism 7-Software durchgeführt wurde.

Erwachsene Milben wurden von Kaninchen gesammelt, die auf natürliche Weise infiziert waren, Deraya-Universität, Minia, Ägyptens Tierheim. Die infizierten Hautproben wurden von den Rändern der Läsionen abgekratzt, dann auf Petrischalen übertragen und in einem Inkubator mit biochemischem Sauerstoffbedarf (BSB) 30 Minuten lang bei 35 °C inkubiert.

Eine Petrischale mit Milben wurde mit 2 ml Verdünnungsextrakt (20 %) gefüllt und die Platten anschließend in BSB inkubiert. Reaktionsbeobachtungen wurden 1, 12 und 24 Stunden nach der Anwendung gemacht. Petrischalen wurden bei einer Umgebungstemperatur von 25 °C und einer relativen Feuchtigkeit von 75 % inkubiert, mit einer 5 % Ivermectin (1 cm3/l)-Gruppe als Positivkontrolle und destilliertem Wasser als Negativkontrolle. Durch Stimulierung der Milben mit einer Nadel wurde der Tod der Milbe bestätigt; die Milbe galt als tot, wenn sie keine Reaktion zeigte.

Die Studie wurde 4 Wochen lang an männlichen erwachsenen Kaninchen (mit einem Gewicht von 2,8–3,2 kg) durchgeführt, die infiziert waren. Die Ohren der Tiere zeigten klinische Anzeichen einer Räudeinfektion, wie Hyperverhornung, Entzündung, Rötung, Juckreiz und Reizbarkeit. Die mikroskopische Milbenidentifizierung in Hautabstrichen bestätigte dies zusätzlich. Vier Gruppen zu je fünf Kaninchen bestanden aus zwanzig Tieren wie folgt: Fünf Kaninchen bildeten die normale Gruppe, die Paraffinöl-positive-Kontrollgruppe. Die mit Ivermectin behandelte Gruppe (5 % Ivermectin). Die Peel-Oil-Gruppe (20%-Peeling-Öl in Paraffinöl). Berichten zufolge wurde Paraffinöl, ein Mineralöl, als Verdünnungsmittel für das Schalenöl gewählt, da es nur geringe Auswirkungen auf Milben hat35. Jede Gruppe wurde in einem separaten Käfig gehalten und jede Gruppe erhielt eine Behandlung, indem sie die infizierten Ohren einmal täglich eintauchte. Für die Fütterung aller Kaninchen wurden Stahltrichter verwendet, und Wasser war jederzeit verfügbar. Die Kaninchen wurden alle zwei Tage beobachtet, um ihre klinische Genesung zu beurteilen. Ziel war es, Anzeichen einer Besserung der Läsionen zu finden, wie z. B. das Fehlen von Reizungen und Rötungen, eine Glättung der Haut, den Beginn der Haarentwicklung aufgrund der Infektion und das Aufhören der Schorfbildung10. Von den erkrankten und geheilten Bereichen jedes Kaninchens wurden alle drei Tage Hautabschürfungen entnommen und im Verlauf der Therapie mit einem LEICA-DM1000-Mikroskop mit Digitalkamera (LEICA, EC3, Deutschland) mikroskopisch auf Sarkoptesmilben untersucht10 .

Gewebeproben wurden null und drei Wochen nach Beginn der Therapie mit 20 % Peelingöl sowie Ivermectin aus gesunden und infizierten Ohren entnommen. Anschließend wurden die Proben in Ethylalkoholen zunehmender Stärke getrocknet, mit Xylol sterilisiert, mit bei 55–60 °C geschmolzenem Paraffin infundiert und schließlich in Paraffinwachs eingelegt. Anschließend wurden die Proben in 10 % gepuffertem Formalin konserviert. Entparaffinierte, rehydrierte und mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) gefärbte „3–5 m dicke“ Gewebeschnitte wurden mit einem Lichtelektronenmikroskop untersucht36.

Unter Verwendung eines digitalen Homogenisators (Branson-Digital-Homogenizer®, Danbury, CT, USA) wurden 100 mg der untersuchten Gewebe in 1 ml TRIzolTM RNA-Extraktionsreagenz (Amresco, Solon, OH, USA) homogenisiert. USA). Die RNA-Extraktion aus der Biopsieprobe erfolgte gemäß den Anweisungen des Herstellers. RevertAid H-minus First Strand cDNA Synthesis Kits (#K1632, Thermo Science Fermentas, St. Leon-Ro, Deutschland) wurden verwendet, um cDNA aus der extrahierten RNA für vergleichbare Mengen an Gesamt-RNA in allen Proben zu erzeugen. Die qRT-PCR wurde auf dem Step One Plus-System von Applied Biosystems unter Verwendung der cDNA als Vorlage durchgeführt. Die Primer wurden mit der NCBI-Primer-Blast-Software erstellt und von Invitrogen hergestellt. Unter Verwendung des GAPDH-Gens als Housekeeping-Gen wurden die Daten mit dem 2CT-Ansatz analysiert31. Tabelle 1 listet die verwendeten Primersequenzen auf.

Unter Verwendung der Software Cytoscape 3.9.1 (https://www.cytoscape.org/)37 und des darin integrierten Krankheitsabfragetools STRING, das ein Netzwerk für die wichtigsten menschlichen Proteine, die mit der abgefragten Krankheit in Zusammenhang stehen, aus einer wöchentlich aktualisierten Webquelle für Krankheiten abruft Datenbank (https://string-db.org/)38 Als Suchbegriff wurde Scabies und als Arttyp „Human sapiens“ ausgewählt. Der Konfidenzwert wurde auf 0,4 festgelegt und die Standardeinstellungen für die übrigen Parameter wurden zur Erstellung des PPI-Netzwerks verwendet39.

Die Hub-Gene werden mithilfe von Ranking-Techniken wie Grad, Edge Percolated Component (EPC), Maximum Neighborhood Component (MNC), Dichte der Maximum Neighborhood Component (DMNC) und Maximal Clique Centrality (MCC) identifiziert B. Engpass, Exzentrizität, Nähe, Radialität, Zwischenmäßigkeit, Spannung und Clusterkoeffizient. Cytoscape gilt als nützliche Explorationsschnittstelle für die wichtigsten Knoten in PPI-Netzwerken40,41.

In der aktuellen Untersuchung haben wir ein frei zugängliches Bioinformatik-Webtool eingesetzt (ShinyGO v0.76.3). Unter Verwendung der vielen zugänglichen Bioinformatik-Datenbanken ist es möglich, sowohl eine Gen-Ontologie-Anreicherungsanalyse als auch eine Signalweg-Anreicherungsanalyse durchzuführen. ShinyGO wurde verwendet, um die Genontologie und Anreicherungsanalyse an den 16 Genen durchzuführen, um die zellulären Elemente, molekularen Funktionen und biologischen Prozesse zu bestimmen, die von diesem Gensatz beeinflusst wurden. ShinyGO ruft umfassende Beschreibungen biologischer Signaltransduktionswege aus zahlreichen Datenbanken ab42.

Die Methoden des molekularen Dockings zielen darauf ab, die beste Bindungsorientierung eines Liganden an einen Rezeptor vorherzusagen. Es schlägt mehrere geeignete Positionen des Liganden innerhalb der aktiven oder Andockstelle eines Rezeptormoleküls vor. In dieser Studie wurden zwanzig identifizierte Verbindungen einer In-silico-Studie unterzogen, bei der ein Screening auf drei verschiedene wichtige Proteinziele durchgeführt wurde, die stark daran beteiligt sind Wir untersuchen den Prozess der Krätze-Infektion und suchen nach potenziellen Zielen an der Milbe selbst als akarizider Wirkung, um so tief in die mechanistische anti-skabietische Wirkung von Orangenöl einzudringen. Zu den ausgewählten Zielen gehören IL-1, das hochwirksam T-Zellen mit regulatorischen Funktionen stimuliert, und IL-6, das an der Bildung von Th17-Lymphozyten und der Freisetzung von IL-1743 beteiligt ist. Diese Zytokine wurden als eines der Hauptmoleküle identifiziert, die für allergische Th2-Typ-Entzündungen in der immunologischen Reaktion auf Krätze verantwortlich sind, zusammen mit TNF-, das für die Aktivierung alternativer Makrophagen von Bedeutung ist44. GSH, das mit dem Krätze-Abwehrsystem verbunden ist, ist an einer Vielzahl von Prozessen beteiligt, die für den Schutz der Zellen vor Sauerstoff und oxidativen Schäden durch freie Radikale entscheidend sind45. Seine ausgeprägte antioxidative Wirkung macht es zu einem potenziellen Angriffspunkt für die akarizide Wirkung des Öls46. In unserer Docking-Untersuchung haben wir den Liganden validiert und die vielen angedockten Posen mit dem Computerprogramm MOE 2019.010 visualisiert. TNF-komplexiert mit seinem Liganden (PDB-ID-Code: 2AZ5) ist das letzte Protein und GST ist das andere Proteinziel der Milben-Delta-Klasse. Das erste Proteinziel ist (IL-1), dargestellt durch den PDB-ID-Code des Proteins 6Y8M in Cokristallisation mit IL-6, wie durch den PDB-ID-Code 1ALU widergespiegelt, und seinen inhibierenden Liganden SX2 (a-Brom-Amido-Pyridin). -Derivat)47 dargestellt durch Proteine (PDB-ID-Code: 3EIN), die ausgewählten Ziele wurden über das Internet aus der Datenbank der Proteine (http://www.rcsb.org/pdb) erworben.

Die MD-Simulationen wurden mit NAMD 3.0.0 durchgeführt. Software48,49. Das Charmm-36-Kraftfeld ist in dieser Software implementiert. Die Proteinstruktur wurde auf fehlende Wasserstoffe untersucht, die Protonierungszustände der Aminosäurereste wurden eingestellt (pH = 7,4) und die kokristallisierten Wassermoleküle wurden mit dem QwikMD-Toolkit der VMD-Software entfernt. Die gesamte Anordnung wurde dann in einen 20-Lösungsmittel-Puffer mit 0,15 M Na+- und Cl--Ionen in einer orthorhombischen Box mit TIP3P-Wasser gepackt. Nach 5 ns Äquilibrierung wurden die Systeme einem Energieminimierungsprotokoll unterzogen. Force Field Toolkit (ffTK), ein Plugin für die VMD-Software, wurde zur Bestimmung von Ligandeneigenschaften und -topologien verwendet. Nachdem die Parameter- und Topologiedateien vorbereitet waren, wurden sie in VMD importiert, damit die Protein-Ligand-Komplexe genau gelesen und die Simulationen durchgeführt werden konnten.

Die Daten wurden mit dem Statistikprogramm GraphPad-Prism-Version 9 (GraphPad, La-Jolla, CA, USA) tabellarisch erfasst. Um statistische Unterschiede zwischen den Gruppen zu bewerten, wurde der ANOVA-Test durchgeführt, gefolgt vom Bonferroni-Post-Hoc-Test für Mehrfachvergleiche. Der Schwellenwert für die statistische Signifikanz liegt bei einem p-Wert von 0,05 oder weniger.

Ägyptische C. reticulata-Schalen ergaben 2,6 % v/w ätherisches Öl im Frischgewicht, waren farblos mit einem charakteristischen Geruch, leichter als Wasser, klar, transparent und sowohl bei Raumtemperatur als auch bei 4 °C nicht viskos. Mittels GC-MS-Analyse wurden insgesamt 20 Verbindungen identifiziert, was 98,91 % aller gefundenen Verbindungen ausmacht (Tabelle 2, Abb. 2, 3). Die identifizierten Verbindungen 1–20 gehörten zu verschiedenen chemischen Klassen, darunter Monoterpen, Phenylpropen, Fettalkohol und Sesquiterpen (Tabelle 2, Abb. 3). wobei Monoterpene 92,16 % der insgesamt identifizierten Verbindungen ausmachten, gefolgt von Phenylpropen (3,01 %), Fettalkohol (2,36 %) und Sesquiterpen (1,38 %) (Tabelle 2). Vierzehn Monoterpenverbindungen (92,16 %) wurden identifiziert; Die Bandbreite reicht von zyklischen Kohlenwasserstoffen (D-Limonen 4, γ-Terpinen 6, 73,32 %), die den Hauptölanteil darstellten, bis hin zu sauerstoffhaltigen zyklischen Kohlenwasserstoffen ((-)-Isomenthon 10, Terpinen-4-ol 11, (-)-Carvon 14 , 3,32 %), und sauerstoffhaltiger azyklischer Kohlenwasserstoff (Linalool 8, Citronellol 13, Geraniol 15, 8,78 %), azyklischer Kohlenwasserstoff (α-Myrcen 3, α-Ocimen 5, 2,84 %), bizyklischer Kohlenwasserstoff (α-Pinen 1, Sabinen 2). , 3,45 %), zu sauerstoffhaltigem bizyklischem Kohlenwasserstoff (Kampfer 9, 0,45 %) (Tabelle 2, Abb. 3). Außerdem enthielt die Phenylpropen-Klasse (3,01 %) 2,70 bzw. 0,31 % Estragol 12 bzw. Anethol 17. Die nachgewiesene Fettalkoholklasse enthielt nur 1-Octanol 7 und 1-Decanol 16, was 2,36 % entspricht (Tabelle 2, Abb. 3). Andererseits wurden drei Sesquiterpenverbindungen (1,38 %) identifiziert, die von einem bicyclischen Kohlenwasserstoff (Caryophyllen 19, (+)-Valencen 20, 1,00 %) bis zu einem tricyclischen Kohlenwasserstoff (α-Copaen 18, 0,38 %) reichen (Tabelle 2, Abb. 3).

GC/MS-Spektrum für Citrus reticulata-Schalenöl.

Strukturen identifizierter Verbindungen mittels GC/MS-Analyse aus Citrus reticulata-Öl, das aus Schalen isoliert wurde.

Der Literatur zufolge variiert die chemische Zusammensetzung ätherischer Öle je nach Alter der Pflanze, Erntezeitpunkt, geografischer Lage und Umweltbedingungen50. Der indische C. reticulata schält ätherisches Öl anders als der ägyptische und hat 80 Verbindungen, wobei Monoterpen (63,80 %) hauptsächlich Limonen (50,42 %), Myrecen (3,03 %) und α-Terpineol (1,19 %) darstellt, während Sesquiterpen ( 12,98 %) besteht hauptsächlich aus α-Copaen (1,49 %), β-Copaen (1,30 %) und α-Humulen (1,23 %). Das indische C. reticulata-Öl zeichnet sich durch seinen hohen Gehalt an Fettsäuren (8,73 %) und Aldehydgehalt (7,08 %), hauptsächlich n-Hexadecansäure (5,65 %) und α-Sinensal (3,14 %) aus51. Das aus vollreifen, reifen indischen Fruchtschalen von C. reticulata isolierte ätherische Öl enthielt dagegen 37 verschiedene Bestandteile (99 %). Zu den Hauptbestandteilen gehörten Limonen (46,7 %), Geranial (19,0 %), Neral (14,5 %), Geranylacetat (3,9 %), Geraniol (3,5 %), Caryophyllen (2,6 %), Nerol (2,3 %), Nerylacetat (1,1 %) und andere26.

Die in Burundi angebauten ätherischen Ölbestandteile von C. reticulata enthielten 58 Bestandteile52. Die am weitesten verbreitete chemische Kategorie waren Monoterpenkohlenwasserstoffe (94,7 %). Limonen machte 84,8 % der Gesamtzusammensetzung aus, gefolgt von -Terpinen (5,4 %), Myrcen (2,2 %) und -Pinen (1,1 %). Germacren D und Valencen waren die Hauptbestandteile der Sesquiterpenkohlenwasserstoffe, die nur 0,2 % der Gesamtzusammensetzung ausmachten. Verbindungen, die Sauerstoff aus verschiedenen chemischen Gruppen enthalten, machten 2,3 %52 aus. Die beiden wichtigsten chemischen Gruppen waren Terpenalkohole (0,7 %) und aliphatische Aldehyde (0,7 %). Linalool (0,7 %), Octanal (0,5 %) und Decanal (0,2 %) machten den Großteil der Mischung aus. In Konzentrationen von 0,1 % waren Octylacetat, α-Sinensal, Decanol und Perillaldehyd vorhanden. Thymol, α-Sinensal, Methylthymol sowie die Acetatester Bornyl, ɣ-Terpinyl, Geranyl, Citronellyl und Decylacetat wurden alle in Konzentrationen von weniger als 0,05 % gefunden52.

Es wurde berichtet, dass die ätherischen Ölbestandteile von C. reticulata, die in Algerien kultiviert wurden, 24 Bestandteile enthielten. Monoterpenkohlenwasserstoffe stellten die am häufigsten vorkommende chemische Gruppe dar (89,56 %). Die Hauptbestandteile waren Limonen (67,04 %), -Terpinen (15,50 %) und -Pinen (2,75 %). Sesquiterpen-Kohlenwasserstoffe machten einen geringen Anteil (3,26 %) aus, wobei L-Caryophyllen den Hauptbestandteil darstellte53.

Die Literaturübersicht über ätherische Ölbestandteile in C. reticulata, die in verschiedenen Regionen kultiviert werden, bestätigt einige Gemeinsamkeiten. Folglich ist Limonen, ein Kohlenwasserstoff-Monoterpen, ausnahmslos der häufigste Bestandteil in ätherischen Ölen aus Zitrusschalen und macht typischerweise zwischen 60 und 70 Prozent des Öls aus. Limonen kann jedoch geringere Werte aufweisen, wie in voll ausgereiften indischen Fruchtschalen von C. reticulata, wo es auf 46 % sinken kann26. Ebenfalls weit verbreitet sind die folgenden Substanzen: Monoterpene, die typischerweise weniger als 15 % ausmachen, γ-Terpinen, Myrcen und α-Pinen, die eine Häufigkeit von 6,0 %, 3,6 % bzw. 1,5 % erreichen können.

Es wird berichtet, dass nicht-terpenoide oder terpenoide Verbindungen (Aldehyde, Ketone, Ester, Fettsäuren und Phenyl) je nach Anbaugebiet vorhanden sind (1–10 %) oder nicht vorhanden sind, es gibt jedoch keine Gemeinsamkeiten zwischen den Studien, die diese Verbindungen berichten einen Einfluss auf die Aktivität des ätherischen Öls hat oder nicht. Sesquiterpen-Kohlenwasserstoffe sind die vielfältigste Gruppe aller bekannten Chemikalien, und das gilt für die meisten Arten. Zu den am weitesten verbreiteten Gruppierungen zählen häufig auch sauerstoffhaltige Monoterpenalkohole und Monoterpenkohlenwasserstoffe.

Diese Studie untersuchte die antioxidative Aktivität von Mandarinenschalenöl als Fängerpotential gegen H2O2. Die Ergebnisse zeigten, dass die H2O2-Fängerkapazität von Mandarinenschalenöl bei einer Konzentration von 1000 µg/ml im Vergleich zu einer Standard-Ascorbinsäure (IC50 = 139,2 µg/ml) überaus dosisabhängig zunahm. Das heißt, je höher die Konzentration des Öls, desto effektiver fängt es die H2O2-Radikale ab (Abb. 4A).

Die H2O2-Fängeraktivität sowohl des Mandarinenschalenöls als auch des Standards nahm konzentrationsabhängig zu (Abb. 4A). Interessanterweise zeigte Mandarinenschalenöl bei einer Konzentration von 1000 μg/ml die höchste Superoxidentfernungswirkung mit einem IC50-Wert von 176,2 μg/ml (Abb. 4B). Dies weist darauf hin, dass das Öl die Superoxidradikale wirksamer abfängt als die Standard-Ascorbinsäure.

Auch die SOD-Aktivität sowohl des Mandarinenschalenöls als auch des Standards stieg konzentrationsabhängig an (Abb. 4B). Interessanterweise zeigte Mandarinenschalenöl bei einer Konzentration von 1000 µg/ml die höchste Superoxidentfernungswirkung mit einem IC50-Wert von 176,2 µg/ml (Abb. 4B). Dies weist darauf hin, dass das Öl die Superoxidradikale wirksamer abfängt als die Standard-Ascorbinsäure.

Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Mandarinenschalenöl ein starkes Antioxidans mit einer hohen Fähigkeit zum Abfangen von H2O2 und Superoxid ist.

Laut In-vitro-Daten erzielte das Mandarinenschalenöl (20 %) eine bemerkenswerte akarizide Wirkung. Die Milben zeigten eine langsame Bewegung, die eine Stunde nach der Anwendung (PA) begann und bei 24 PA endete, was einer Todesrate von 99 Prozent entspricht, wie durch mikroskopische Analyse ermittelt wurde.

Sarcoptesräude, einige chronische Läsionen und Krusten waren auf und in den Ohren von Kaninchen sichtbar, die mit Sarcoptes scabiei infiziert waren. Diese Tiere litten unter Juckreiz, Stauung, Kratzen und Anorexie, während die mit Mandarinenschalenöl (20 % Schalenöl in Paraffinöl) behandelten Tiere eine allmähliche Verbesserung der klinischen Symptome vom vierten Tag PA bis zum Abschluss des Experiments (drei Wochen PA) zeigten ). Das Fehlen von Reizungen, Blutungen, Schuppenbildung und Unruhe sowie das Auftreten glatter Haut und neuer Haarwuchs waren Anzeichen der Genesung54. Bei den mit Ivermectin behandelten Tieren hingegen besserte sich der Zustand allmählich, der Zustand verschwand jedoch vom siebten Tag der PA bis zum Abschluss der Untersuchung nicht vollständig (Abb. 5).

Untersuchung von Räude-infizierten Kaninchen unter dem Mikroskop, (A) Kontrollgruppe (Paraffinöl), (B) Mandarinenschalenöl-Gruppe (20 % Schalenöl in Paraffinöl), (C) Ivermectin-Gruppe (5 % Ivermectin).

Am fünften Tag PA enthielten die Hautabschabungen aller infizierten Tiere zusammen mit dem Schalenöl und den Ivermectin-Gruppen tote Milben. Als die Tiere am 10. Tag erneut untersucht wurden, waren die toten Milben vollständig verschwunden.

Die Epidermis und Dermis der normalen Haut waren in den histologischen Analysen der normalen Gruppe deutlich sichtbar. Das Stratum corneum und das Stratum granulosum bilden die Epidermis, und in der Dermis sind die retikuläre Schicht, Haarfollikel, Talgdrüsen und Schweißdrüsen sichtbar (Abb. 6A). Hautproben der Kontrollgruppe zeigten hingegen eine veränderte Histologie, die für diese Parasiteninfektion üblich ist55. Hauterosion konnte als Folge der geschichteten Ablösung des Plattenepithels, der Hyperkeratose, der Akanthose und der gefalteten, scheinbar verletzten Haut beobachtet werden. Darüber hinaus wiesen die Epidermis, die entzündliche Zellinfiltration und die hypergranulierende Dermis alle nekrotische Trümmer auf, gemischt mit verschiedenen Milbenstadien (Abb. 6B).

Mikroskopische Untersuchung der Haut verschiedener Tiergruppen, (A) normale Architektur der Haut: e; Epidermis, d; Dermis, HF; Haarfollikel, (B) Kontrollgruppe, die Hautschäden mit Hyperkeratose zeigt (rote Pfeile), in der Haut eingebettete Milbenreste (blaue Pfeile), Hypergranulation der Dermis (grüne Pfeile) , schwere Akanthose mit zellulärer Infiltration (schwarze Pfeile), (C) Mandarinenschalenölgruppe mit Wiederherstellung der normalen Architektur, mit leichter Infiltration (roter Pfeil), gesunde Talgdrüsen (gelber Pfeil) und Haarfollikel (schwarze Pfeile), (D) Ivermectin-Gruppe mit mäßiger Schädigung mit Hyperkeratose (roter Pfeil), reife Milben mit in der Dermis eingebetteten Eiresten (schwarzer Pfeil), umgeben von zellulärer Infiltration (grüner Pfeil) und etwas Talgdrüsenentzündung (gelbe Pfeile).

Außerdem zeigten Biopsieproben von Tieren, denen Mandarinenschalenöl (20 % Schalenöl in Paraffinöl) verabreicht wurde, eine leichte Zellinfiltration, einen Mangel an Milben, eine Zunahme der Anzahl von Haarwuchsfollikeln und das Auftreten normaler Talgdrüsen des Fortschritts in den Oberflächenschichten der Haut (Abb. 6C). Der Hautzustand verbesserte sich in der Gruppe, die eine Ivermectin-Behandlung erhielt, wo nur wenige Entzündungszellen und Hyperkeratose beobachtet wurden. In der äußersten Hautschicht waren die Überreste der Milben eingebettet zu sehen. In bestimmten Regionen traten Zellfiltration und Talgdrüsenadenitis auf (Abb. 6D).

Die proinflammatorischen Zytokine (IL-1β, IL-6), das pleiotrope Zytokin (IL-10) und das Monozyten-Chemoattraktiv-Protein-1 (MCP-1) waren alle gemäß den Ergebnissen der q-PCR bei den mit Mandarinenschalenöl (20 % Schalenöl in Paraffinöl) behandelten Tieren herunterreguliert. Andererseits wurde ein zwei- bis siebenfacher Anstieg von ICAM-1, MMP-9, VEGF, KGF und TIMP-1 beobachtet (Abb. 7).

Relative Genexpression im Hautgewebe verschiedener Tiergruppen mittels qRT-PCR Nach Normalisierung auf GAPDH, (A) I-CAM, (B) IL-1, (C) IL-10, (D) MCP-1, (E) TIMP-1, (F) MMP-9, (G) KGF, (H) IL-6 und (I) VEGF. Im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe zeigen die Daten eine Steigerung der Expression um den Faktor zwei. Der Mittelwert ± SD wird als Balken angezeigt. Ein einfaktorieller ANOVA-Test wird verwendet, um zu bestimmen, ob ein signifikanter Unterschied zwischen den Kategorien besteht, und zwar über (a) p < 0,05 im Gegensatz zur normalen Kontrollgruppierung und (b) p < 0,05 im Gegensatz zur marktmedikamenteninduzierten Kategorie.

Das erstellte PPI-Netzwerk bestand aus 296 Knoten und 1725 Kanten, was in den Abbildungen dargestellt ist. S1–S3.

Das CytoHubba-Plugin Cytoscape gilt als nützliche Erkundungsschnittstelle für die wichtigsten Knoten in den PPI-Netzwerken und dient zur Bestimmung der Hub-Gene mithilfe von Ranking-Methoden. Die in (Tabelle 3) gezeigten Ergebnisse zeigten, dass sich 16 Knoten in mehr als einer Analysemethode wiederholten. Bezüglich des Vorkommens wies IL1B den höchsten Wert auf, da es in 10 der 12 Methoden auftrat, gefolgt von Il6 und TNF-α mit jeweils einem Wert von 9, während CD4 achtmal, IL10 und IL2 siebenmal auftrat (Abb. S2 und S3). ). Man geht davon aus, dass in Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken die am stärksten verbundenen Knoten (Hubs) die Hauptakteure sind und für die größten pathologischen Effekte verantwortlich sind.56 Eine kreisförmige Anordnung der gefilterten Knoten ergab, dass TNF-α und IL6 den höchsten Knotengrad aufwiesen In den 16 Knoten (Abb. 8A) wurde das am häufigsten vorkommende Protein in der CytoHubba-Analyse IL1B mit TNF-α und IL6 für die In-silico-Molekularmodellierung ausgewählt57,58.

(A) Durch ein kreisförmiges Netzwerkdesign stellen die Ränder Wechselwirkungen zwischen Proteinen dar und die Knoten dienen als Hub-Proteinkriterien. Die Konnektivität jedes Proteins wird durch die Dimension der Knoten dargestellt; Je größer der Knoten, desto größer ist seine Verbindung mit anderen Knoten im Netzwerk. (B) Funktionelle Anreicherungsanalyse von gefilterten 16 Protein-kodierenden Genen durch ShinyGO (https://www.genome.jp/kegg/, abgerufen am 12. September 2022) ; (http://bioinformatics.sdstate.edu/go/, abgerufen am 13. September 2022, ein grafisches Tool zur Anreicherung von Gensätzen).

Die Genontologie (GO) gilt als rechnergestütztes bioinformatisches Modell biologischer Systeme, beginnend auf der molekularen Ebene bis hin zur Ebene des Organismus. GO zielt darauf ab, Wissen über die Funktionen von Genprodukten, nämlich Proteinen und nichtkodierenden RNA-Molekülen, bereitzustellen. GO ist in drei Aspekte organisiert. GO Molekulare Funktionen (MF) beschreiben Aktivitäten, die auf molekularer Ebene ablaufen, biologische Prozesse (BP) stellen die größeren Prozesse oder „biologischen Programme“ dar, die durch mehrere molekulare Aktivitäten ausgeführt werden, und zelluläre Komponenten (CC), bei denen es sich um die zellulären Strukturen handelt, in denen ein Gen entsteht eine Funktion ausführt, definieren die spezifischen Gene, die in jeder Zelle exprimiert werden, die Identität und Funktionalitäten dieser Zelle. Die Regulierung der Transkription ist äußerst komplex und führt zu einer unterschiedlichen Genexpression in bestimmten Zellen oder unter bestimmten Bedingungen59. Die Analyse der ausgewählten Gene ergab, dass die positive Regulation und die Phosphorylierung von STAT auf dem JAK/STAT-Signalweg in derselben Reihenfolge der wichtigste biologische Prozess waren, während der Interleukin-6-Rezeptorkomplex die wichtigste molekulare Komponente war, gefolgt vom Keratohyalin-Granulat und dem T-Zell-Rezeptorkomplex. Für die Kategorie „Molekulare Funktion“ wurden gescreente Gene mit der Bindung an Interleukin-4- und -8-Rezeptoren, gefolgt von der Bindung toxischer Substanzen, korreliert. Schließlich wurde festgestellt, dass der KEGG-Signalweg für die ausgewählten Protein-kodierenden Gene an entzündlichen Darmerkrankungen, Malaria und Legionellose beteiligt ist. (Abb. 8B).

Die röntgenkristallographische Struktur von (IL-1β) im Komplex mit seinem Liganden wurde aus der Proteindatenbank (http://www.rcsb.org/pdb/, Code 6Y8M) erhalten. Der Ligand wurde in einer aktiven Tasche mit einem akzeptablen RMSD von 1,311 und einem Energiewert von -5,870 kcal/mol in fünf Wechselwirkungen von Wasserstoffbrückenbindungen sowie einer Wechselwirkung mit ionischen Bindungen erneut angedockt, um die Ergebnisse unserer Forschung zu verifizieren. Die an den H-Brücken-Wechselwirkungen beteiligten Aminosäurereste waren Thr 147, Met 148, Gln 149 und Arg 11 als H-Akzeptor sowie ein weiterer mit Met-148 als H-Donor während der ionischen Wechselwirkung wurde mit Arg 11 angetroffen. Der Dock-Score der zwanzig Verbindungen gegen 6Y8M ist in den Tabellen S1–S4 zusammengefasst. Den Docking-Ergebnissen zufolge hatte Verbindung 15 (Geraniol) einen Docking-Score von − 5,881 kcal/mol, was weniger günstig war als die kinetische Energie, die durch den cokristallisierten Liganden (Tabelle S5) mit Zwei-Wasserstoffbrücken-Wechselwirkung erhalten wurde einer als H-Donor mit Asn 108 und der andere als H-Akzeptor mit Lys 109, während Verbindung 16 (1-Decanol) im Vergleich zum cokristallisierten Liganden mit drei Wasserstoffbrückenbindungen einen ungefähr ähnlichen Energiewert von − 5,625 kcal/mol erreichte als H-Akzeptor durch die Hydroxylgruppe von 1-Decanol und die Aminosäurereste Gln 149, Thr 147 und Arg 11, die den Wechselwirkungen des co-kristallisierten Liganden ähneln (Abb. 9A,B).

(A) 2D-Aktionen und 3D-Andocken repräsentieren Verbindung 15 (Geraniol) an der erfolgreichen Taschenposition von IL-1 (PDB: 6Y8M), (B) 2D-Aktionen und 3D-Andocken repräsentieren Verbindung 16 (1-Decanol) an der erfolgreichen Taschenposition von IL-1 (PDB: 6Y8M), (C) 2D-Aktionen und 3D-Andocken in Verbindung 15 in der erfolgreichen Taschenposition von IL-6 (PDB: 1ALU), (D) 2D-Beziehungen und 3D-Andocken in Verbindung 16 in die erfolgreiche Taschenlokalisierung von IL-6 (PDB: 1ALU), (E) 2D-Beziehungen und 3D-Docking in Verbindung 17 in der erfolgreichen Taschenlokalisation von IL-6 (PDB: 1ALU), (E) 2D-Beziehungen und 3D-Docking darstellen Verbindung 16 in TNF-Position (PDB: 2AZ5) und (F) 2D-Beziehungen und 3D-Docking präsentieren Verbindung 15 in GST-Position (PDB: 2AZ5) (PDB: 3EIN).

Die röntgenkristallographische Struktur von IL-6 im Komplex mit seinem Liganden wurde von der Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/, Code 1ALU) (Weinsäure) zur Verfügung gestellt. Die Lage des kokristallisierten Liganden (l-(+)-Weinsäure) wurde durch die Docking-Methode mit einem RMSD von 1,758 und einem Energiewert von – 4,191 kcal/mol vorhergesagt. In der in Tabelle S6 gezeigten Art der Kontakte waren H-Akzeptor-Wechselwirkungen mit Arg-182 und Arg-179 vorhanden, ebenso wie ionische Wechselwirkungen und eine Wasserstoffbrücke mit Gln, das als H-Donor fungierte . Es ist interessant festzustellen, dass die Docking-Ergebnisse vieler der 20 sekundären Pflanzenstoffe eine starke Affinität zum Rezeptor zeigten, mit ähnlichen Werten wie der kokristallisierte Ligand (Tabelle S2). Es ist erwähnenswert, dass beide Verbindungen 15 und 16 eine bessere Affinität zur Bindungsstelle von IL-6 als der Ligand zeigten, da sie ΔG von −4,372 bzw. −4,401 kcal/mol aufwiesen. Die Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkungen traten in Form von drei Wasserstoffbrückenbindungsakzeptoren mit den Aminosäureresten Arg 179 und Arg 182 in beiden auf, die dem Wechselwirkungsmuster des cokristallisierten Liganden entsprechen. Darüber hinaus erreichte Verbindung 8 auch einen guten Energiewert von − 4,151 kcal/mol im Vergleich zum Liganden-Score von − 4,191 kcal/mol. (Abb. 9C,D).

Die Proteindatenbank (http://www.rcsb.org/pdb/, Code 2AZ5) lieferte die röntgenkristallographische Struktur von (TNF-), das mit seinem Liganden komplexiert ist. Es wurde gezeigt, dass der kokristallisierte Ligand mit 16 Aminosäureresten verbunden und in einer kleinen Tasche befestigt war, wobei sieben dieser Reste von Kette A und die restlichen neun von Kette B stammten, darunter sechs Tyrosinreste aus jeder Untereinheit des TNF-Dimers. Dieser Inhibitor bindet sich an die aktive Trimerform des Zytokins, stimuliert dessen Dissoziation in die inaktive Dimerform und stabilisiert es60. Der Ligand wurde erneut in der aktiven Tasche angedockt, um unsere Forschung zu verifizieren. Bei Wechselwirkungen mit Rezeptoren baute der Ligand Wasserstoffbrücken mit Gln-61 als H-Donor und mit Tyr-119 als pi-H-Wechselwirkung auf. Die Stellung des kokristallisierten Liganden wurde durch die Docking-Methode mit dem geringsten RMSD und einem Energiewert von –6,923 kcal/mol vorhergesagt. Abbildung 9E, Tabelle S7. Tabelle S3 fasst die Dock-Scores der 20 Verbindungen gegenüber 2AZ5 zusammen. Aufgrund seines Hydroxylanteils und der Aminosäuresequenz Gln 61 war Verbindung 16 die einzige, die einen Dock-Score von − 5,129 kcal/mol mit einer einzelnen Wasserstoffbrückenbindung als H-Donor erreichte (Abb. 9).

Die Protein-Datenbank (http://www.rcsb.org/pdb/, Code 3EIN) verfügt über die röntgenkristallographische Struktur der Delta-Klasse-GST von Drosophila melanogaster. Beim erneuten Andocken von Glutathion wurden vier Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkungen festgestellt, von denen zwei Arg-67 und Ser-66 als H-Akzeptoren und die anderen beiden Glu 65 und Ile 53 als H-Donoren umfassten. Zusätzlich zu den beiden ionischen Wechselwirkungen mit Arg 67 und Glu 65 betrug der Energiewert des Liganden − 5,945 kcal/mol (Tabelle S8). Basierend auf den in Tabelle S4 aufgeführten Docking-Ergebnissen der untersuchten Verbindungen weist Verbindung 15 (Geraniol), die einen G von −5,861 kcal/mol aufwies, hinsichtlich der Energiebewertung starke Ähnlichkeiten zu Glutathion auf. Auf ähnliche Weise wie der kokristallisierte Ligand interagierte Geraniol mit der Bindungsstelle des GST-Rezeptors, indem es zwei Wasserstoffbrücken bildete, eine mit dem Aminosäurerest Ser-66 als H-Akzeptor und die andere mit Glu 65 als an-H-Donor (Abb. 9F).

Um die Docking-Ergebnisse zu validieren, wurde die Docking-Pose von Geraniol mit GST und IL-6 mit der besten Punktzahl einer 50 ns langen MD-Simulation unterzogen. Wie in Abb. 10 gezeigt, erreichte die Geraniol-Modellstruktur eine stabile Bindung innerhalb der Bindungsstelle jedes Proteins mit RMSD-Profilen (~ 2,5 Å), die mit denen der kokristallisierten Liganden (~ 1,7 Å) vergleichbar waren. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Geraniol wahrscheinlich sowohl GST als auch IL-6 hemmt.

RMSDs von Geraniol in GST und IL-6 im Vergleich zum kokristallisierten Liganden jedes Proteins [(A) bzw. (B)] im Verlauf einer 50 ns langen MD-Simulation.

Verschiedene physikalisch-chemische Eigenschaften eines bestimmten Arzneimittels können einen erheblichen Einfluss auf seine Bioaktivität haben, da sie eng mit den Wechselwirkungen zwischen dem Arzneimittel und seinem potenziell vermuteten Ziel verknüpft sind. Kürzlich wurde mit In-silico-Ansätzen ein leistungsstarkes Werkzeug für die Arzneimittelentwicklung eingeführt, um die vorgeschlagene Pharmakokinetik (ADME) von Verbindungen zu bewerten, die eine entscheidende Rolle bei ihren pharmakologischen Aktivitäten spielen, insbesondere in den frühen Phasen des Screenings nach Leitverbindungen. Daher ist die Messung dieser Parameter von großem Wert bei der Auswahl eines wirksamen Medikamentenkandidaten. Die Regeln von Lipinski und Veber sind erfolgreiche Instrumente zur Durchführung eines solchen Screenings, da die Fünferregel von Lipinski besagt, dass eine Verbindung arzneimittelähnliche Aktivität aufweist, wenn mindestens drei der folgenden Kriterien erfüllt sind: eine Molekülmasse von weniger als 500 Da, maximal fünf Wasserstoff Donoren, maximal 10 Wasserstoffbrückenbindungsakzeptoren und ein Verteilungskoeffizient zwischen Octanol und Wasser (LogP (o/w)) kleiner als 5. Nach der Veber-Regel ist eine Verbindung oral aktiv, wenn sie 10 oder weniger drehbare Bindungen aufweist und a polare Oberfläche (PSA) größer als 140 Å. Zur Vorhersage arzneimittelähnlicher Eigenschaften verwendeten wir Reaxys. Das Screening der Verbindungen 15 und 16 ergab, dass sie alle den Regeln von Lipinski und Veber entsprachen (Abb. 11).

In silico Drogenähnlichkeit (Lipinski- und Veber-Regeln) der Verbindungen 15 und 16.

Ätherische Öle (EOs) werden im Allgemeinen gut vertragen, wie ihre weit verbreitete Verwendung in Lebensmitteln, Haar- und Hautpräparaten zeigt61. Im Vergleich zu herkömmlichen Medikamenten verursachen EOs aufgrund ihrer vielfältigen Wirkstoffe weniger wahrscheinlich Resistenzen61. EOs können zusätzlich zu ihren scabiziden Eigenschaften auch antibakterielle, entzündungshemmende und juckreizlindernde Eigenschaften haben8,14. All diese adjuvanten Eigenschaften sind besonders attraktiv für die Behandlung von Krätze.

Da Milben tief in die Haut eindringen, ist die Pathogenese der Krätze kompliziert und umfasst eine Reihe von Mechanismen, einschließlich der Persistenz von Parasiten, die sich sowohl auf die Struktur als auch auf die Funktion der Haut auswirkt62. All diese Elemente wirken zusammen und machen die Behandlung unwirksam, insbesondere angesichts der Tatsache, dass die meisten synthetischen Medikamente Milben abtöten, anstatt das Immunsystem zu verändern oder die Gewebereparatur zu fördern. Vor diesem Hintergrund können pflanzliche Phytochemikalien aufgrund ihres breiten therapeutischen Potenzials und ihrer vernachlässigbaren Nebenwirkungen als sicherer Ersatz für synthetische Optionen zur Ausrottung von Infektionskrankheiten dienen63. Berichten zufolge haben Zitrusfrüchte immunstimulierende, entzündungshemmende, antimikrobielle und antioxidative Eigenschaften64,65,66. Es hatte eine beträchtliche antibakterielle Wirksamkeit gegen S. aureus- und Candida-Hautinfektionen, einschließlich oraler und vaginaler Candidiasis65,67,68,69,70. Faszinierende Studien haben gezeigt, dass Zitrusöl die Art und Weise verändern kann, wie Entzündungsreaktionen zum Ausdruck kommen, indem es entzündungsfördernde Zytokine unterdrückt und die Abwehrbarrieren der Haut stärkt71. Zum akariziden Potenzial von Mandarinenschalenöl gegen Sarcoptes scabiei wurde nach unserem Kenntnisstand noch keine Untersuchung durchgeführt.

Daher untersuchte die aktuelle Studie die GC/MS-Zusammensetzung von Mandarinenschalenöl und bewertete die Fähigkeit des Öls, Krätzemilben abzutöten, sowohl in In-vitro- als auch in In-vivo-Tests. Während oder nach der Anwendung von Mandarinenschalenöl traten keine Symptome von Hautreizung, Entzündung oder Unbehagen auf. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Orangenschalenöl 24 Stunden nach der Anwendung eine erhebliche akarizide Wirkung auf Sarcoptes scabiei-Milben haben könnte. Nach dem Absterben der Milben zeigte die Haut der Tiere gesunde Symptome, darunter das Aufhören von Entzündungen und Hyperkeratose, die Entstehung neuer Hautschichten und den Beginn eines neuen Haarwuchses. Dies geschah zeitgleich mit Berichten über die wirksame Behandlung von Kaninchenräude72. Diese vollständige Erholung war nach drei Wochen zu beobachten, wohingegen die Heilung in der Ivermectin-Gruppe bis zum Abschluss des Experiments (vier Wochen) anhielt, ohne dass es zu einer vollständigen Genesung kam. Die histopathologischen Befunde zeigten, dass sich die Dermis und Epidermis der behandelten Tiere verbesserten, Entzündungszellen abnahmen und keine Milbenreste in den Hautschichten vorhanden waren. Das Absterben der Milben sowie das Fehlen von Entzündungen, Juckreiz, Hautschäden und Schuppenbildung sind die Hauptursachen für die Verbesserung55. Im Gegensatz dazu veränderten sich die Hautschichten der Ivermectin-Gruppe im Laufe der Therapie allmählich und am Ende der Untersuchung waren noch einige Entzündungszellen sowie Spuren abgestorbener Milben sichtbar. Dies könnte durch die starke milbenhemmende Wirkung von Ivermectin sowie durch den häufigen Juckreiz und die allergischen Reaktionen, die durch die topische Anwendung von Deltamethrin hervorgerufen werden, erklärt werden, was die Entzündung verlängert und das Auftreten guter Indikatoren zusätzlich verzögert73.

Epidermale Keratinozyten als erste Verteidigungslinie gegen gefährliche äußere Eindringlinge müssen genutzt werden, um die modulierenden Wirkungen von Mandarinenschalenöl auf die Pathophysiologie von Krätze zu verstehen. Um verschiedene Infektionen zu erkennen und Immunreaktionen auszulösen, erzeugen Keratinozyten auf ihrer Oberfläche Erkennungsrezeptoren. Diese Rezeptoren ermöglichen es ihnen, Zytokine, Chemokine und antimikrobielle Peptide abzusondern, die dabei helfen, Entzündungszellen anzulocken74. Jedes Ungleichgewicht in der Aktivität der Keratinozyten, die für die Kontrolle der immunologischen Homöostase der Haut von entscheidender Bedeutung sind, kann zu Krankheiten führen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine erhebliche Menge an Genen in den Hautfibroblasten und Keratinozyten ihre Expression verändert, wenn sie lebenden, grabenden Krätzemilben oder deren Abfallprodukten (einschließlich Speichel oder Eiern) ausgesetzt werden, wodurch andere Zelltypen weiter aktiviert werden75. Als Reaktion auf Krätze kommt es daher bei vielen anderen Zellkategorien der Haut, wie Lymphzellen, Endothelzellen oder LCs und dendritischen Zellen, zu komplexen Wechselwirkungen (Cross Talk), was zur Entwicklung von entzündlichen und oxidativen Stresszuständen führt. Dies könnte zu einer Zunahme reaktiver Sauerstoffspezies wie H2O2 führen, was zur Lipidperoxidation führt und sich negativ auf die Struktur und Durchlässigkeit der Haut auswirkt. In unserer Untersuchung bestätigte eine schnellere klinische und parasitologische Erholung die potenzielle antioxidative Wirkung von Mandarinenschalenöl, indem das veränderte Oxidationsmittel-/Antioxidantien-Gleichgewicht bei behandelten Tieren wieder normalisiert wurde. Es wird angenommen, dass Antioxidantien die Wundheilung beschleunigen, indem sie den oxidativen Stress auf der Wunde reduzieren. Sie sind wichtig, um zu verhindern, dass biologische Elemente wie DNA, Proteine, Lipide und Körpergewebe geschädigt werden, wenn reaktive Spezies vorhanden sind31. Da die erhöhten ROS-Spiegel an der Verletzungsstelle die Hauptverursacher des Kollagenabbaus, des Abbaus der extrazellulären Matrix (ECM), einer Abnahme der Gefäßentwicklung und Reepithelisierung sowie eines Anstiegs entzündungsfördernder Zytokine sind, Da all dies die Entzündung verlängert, könnte ein Extrakt mit ROS-Fängerpotenzial eine Schlüsselkomponente des Heilungsprotokolls sein31.

Der erwartete Wirkungsmechanismus von Mandarinenschalenöl bei mit Krätze infizierten Kaninchen ist in Abb. 12 schematisch dargestellt. Berichten zufolge aktivieren infiltrierende Milben die Keratinozyten der Haut und weisen die Fähigkeit auf, die Reaktion des Immunsystems zu unterdrücken, indem sie die Expression von Genen senken von i-CAM-1, einer intrazellulären Adhäsionsmolekülstruktur, die auf endothelialen Oberflächenzellen beobachtet wird. Dies verringert die Blutversorgung und die Immunzellen an der Eindringstelle und verringert die Schutzfähigkeit sowohl der Lymphozyten als auch der Neutrophilen. Andererseits erhöht eine Infektion MCP-1, ein Chemokin, das Immunzellen stimuliert und Entzündungen verursacht76. Klinische Anzeichen werden vier bis sechs Wochen nach der Diagnose von Krätzemilben nicht bemerkt. Dies liegt daran, dass die regulatorischen T-Zellen (Typ 1) dazu angeregt werden, IL-10 zu produzieren, ein Zytokin mit entzündungshemmenden Eigenschaften, das der Mensch zur Vorbeugung von Entzündungs- und Autoimmunerkrankungen benötigt77. Darüber hinaus erhöhen Milbenprodukte, die Keratinozyten sensibilisieren, wahrscheinlich die Produktion von VEGF, das zusätzlich von den Milben induziert wird, um die Angiogenese zu steigern. Die Milben erhöhen den Blutfluss in der Region, um die benötigte Nahrung aus der verzehrten Nahrung zu erhalten, was die Entzündung verschlimmert77. Eine verzögerte Reepithelisierung der Wunde ist das Ergebnis einer verringerten Signalübertragung des KGF-Rezeptors, die auch die Proliferationsrate epidermaler Keratinozyten entlang des Wundrands verringert. Matrix-Metalloproteinase (MMP-9) gehört zu einer Reihe von Hydrolase-Enzymen, die bei vielen schweren Erkrankungen exprimiert werden, darunter Wunden, Osteoarthritis, Ischämie und Viruserkrankungen. Die Entzündung erhöht auch den MMP-9-Spiegel deutlich78. Bei fast allen Parasiteninfektionen wird MMP-9 zum Umbau von Gewebe eingesetzt, was häufig die Produktion von ECM-Molekülen, einschließlich Kollagen II und Aggrecan, verlangsamt79. TIMP-1 (Gewebehemmer der Met-Alloproteinase) reguliert streng die biologischen Aktivitäten von MMPs, und die Proteolyse resultiert aus einem Ungleichgewicht im MMPs/TIMPs-Verhältnis80. Die Umkehrung der Aktivierung dieses Netzwerks miteinander verbundener Gene könnte daher ein nützlicher Behandlungsansatz sein, um die Ausbreitung von Krätze zu verlangsamen. Bei topischer Anwendung von CSE nahm die Expression von IL-1, 6, 10, VEGF, MMP-9 und MCP-1 signifikant ab, wohingegen die Expression von i-CAM-1, KGF und TIMP-1 signifikant zunahm.

Der vorgeschlagene Mechanismus für die Wirkung von Mandarinenschalenöl auf mit Krätze infizierte Kaninchen.

Das Ergebnis war eine Verbesserung der Immunität des Wirts gegen eindringende Milben, ein Rückgang der proinflammatorischen Zytokine und ein Anstieg der entzündungshemmenden Zytokine, was die ungünstigen Symptome umkehren und zu einer verbesserten Reepithelisierung, einer schnellen Genesung und einem Rückgang der Entzündung führen könnte .

Angesichts der Fälle von Behandlungsversagen und dem Auftreten von Resistenzen hat sich die wirksame Bekämpfung von Krätze mit den verfügbaren akariziden Arzneimitteln als äußerst schwierig erwiesen. Mit einer bioziden Wirkung, die mit der herkömmlicher synthetischer Behandlungen vergleichbar ist, zeigte diese Studie die akarizide Wirksamkeit des Mandarinenschalenöls gegen Räudemilben bei Kaninchen. Die Arbeit untersuchte die Zusammensetzung des Öls und ergab das Vorhandensein verschiedener Kohlenwasserstoffe und ihrer sauerstoffhaltigen Formen mit nachgewiesener biozider Wirkung. Darüber hinaus wurde das Öl mit verschiedenen Techniken an natürlich mit Räude infizierten Kaninchen getestet und zeigte im Vergleich zu marktüblichen Wirkstoffen eine höhere Wirksamkeit und Sicherheit. Das Mandarinenschalenöl stellt eine ideale Alternative zu kommerziellen Medikamenten zur Bekämpfung von Spinnentieren dar, die Menschen und Tieren schaden können und gleichzeitig wirtschaftlich, sicher und umweltfreundlich sind. Diese Kandidaten können erfolgreich zur Entwicklung neuartiger Biozide für Anwendungen zur Verbesserung der Landwirtschaft und zum Schutz von Nutztieren eingesetzt werden.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem Artikel (und seinen ergänzenden Informationsdateien) enthalten.

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Das Dekanat für wissenschaftliche Forschung der Umm Al-Qura-Universität unterstützte diese Arbeit mit dem Grant-Code: 22UQU4310013DSR08, und die Autoren möchten ihnen dafür danken. Auch die Identifizierung des Fruchtnamens der Pflanze wurde freundlicherweise von Abdel Haleem A. Mohammed vom Department-of-Flora-and-Phytotaxonomische-Forschung am Horticulture-Research-Institute, Dokki, Kairo, Ägypten, zur Verfügung gestellt.

Abteilung für Pharmakognosie, Fakultät für Pharmazie, Beni-Suef-Universität, Beni-Suef, Ägypten

Abeer H. Elmaidomy

Abteilung für Pathologie, Fakultät für Pharmazie, Deraya-Universität, Minya, Ägypten

Nehad M. Reda Abdel-Maqsoud

Abteilung für Biochemie, Fakultät für Pharmazie, New Valley University, Kharga, New Valley, Ägypten

Omar. Y. Tammam

Abteilung für Pharmazeutische Chemie, Fakultät für Pharmazie, Deraya-Universität, Minya, Ägypten

Islam M. Abdel-Rahman

Abteilung für Biochemie, Fakultät für Pharmazie, Deraya-Universität, New Minya, Ägypten

Mahmoud A. Elrehany

Abteilung für Pharmaziepraxis, Fakultät für Pharmazie, King Abdulaziz University, Jeddah, Saudi-Arabien

Hussain T. Bakhsh

Abteilung für medizinische Labortechnik, Fakultät für Angewandte Medizinwissenschaften, Universität Tabuk, Tabuk, Saudi-Arabien

Faisal H. Altemani & Naseh A. Algehainy

Abteilung für Biowissenschaften, Fakultät für Naturwissenschaften, König-Abdulaziz-Universität, Jeddah, Saudi-Arabien

Mubarak A. Alzubaidi

Abteilung für Pharmakognosie, College of Pharmacy, Universität Umm Al-Qura, Mekka, Saudi-Arabien

Faisal Alsenani

Abteilung für Pharmakognosie, Fakultät für Pharmazie, Nahda-Universität, Beni-Suef, 62513, Ägypten

Ahmed M. Sayed

Abteilung für Pharmakognosie, Fakultät für Pharmazie, Deraya-Universität, Minya, Ägypten

Usama Ramadan Abdelmohsen & Eman Maher Zahran

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Konzeptualisierung: URA, AHE; Methodik: AHE, NMRA, OYT, IMAR; Software: MAE, AMS, HTB, FHA, NAA, MAA; formale Analyse: AHE, NMRA, OYT, IMAR; Untersuchung: URA, AHE, EMZ; Ressourcen: MAE, HTB, FHA, NAA, MAA; Datenkuration: URA, AHE, EMZ, MAE, HTB, FHA, NAA, MAA; Schreiben – Originalentwurf: AHE, NMRA, OYT, IMAR; Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung: AHE, NMRA, OYT, IMAR, URA, EMZ Das endgültige Manuskript wurde von allen Autoren nach der Lektüre zur Veröffentlichung freigegeben.

Korrespondenz mit Abeer H. Elmaidomy oder Usama Ramadan Abdelmohsen.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Elmaidomy, AH, Abdel-Maqsoud, NMR, Tammam, OY et al. Das Anti-Krätze-Potenzial von ägyptischem Mandarinenschalenöl durch Herunterregulierung von Entzündungs-/Immun-Cross-Talk: GC-MS- und PPI-Netzwerkstudien. Sci Rep 13, 14192 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38390-5

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Eingegangen: 29. März 2023

Angenommen: 07. Juli 2023

Veröffentlicht: 30. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38390-5

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