Die Analyse der Wirkung von Hyperforin (Johanniskraut) am TRPC6-Kanal führt zur Entwicklung einer neuen Klasse von Antidepressiva

Molecular Psychiatry Band 27, Seiten 5070–5085 (2022)Diesen Artikel zitieren

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Johanniskraut ist ein Kraut, das in der Volksmedizin seit langem zur Behandlung leichter Depressionen eingesetzt wird. Sein antidepressiver Bestandteil Hyperforin weist Eigenschaften wie chemische Instabilität und die Auslösung von Arzneimittelwechselwirkungen auf, die seine Verwendung für individuelle Pharmakotherapien ausschließen. Hier identifizieren wir den kanonischen 6-Kanal des transienten Rezeptorpotentials (TRPC6) als medikamentöses Ziel zur Kontrolle von ängstlichem und depressivem Verhalten und als Voraussetzung für die antidepressive Wirkung von Hyperforin. Wir zeigen, dass ein TRPC6-Mangel bei Mäusen nicht nur zu ängstlichem und depressivem Verhalten führt, sondern auch die Erregbarkeit der CA1-Pyramidenneuronen des Hippocampus und der Körnerzellen des Gyrus dentatus verringert. Mithilfe von Elektrophysiologie und gezielter Mutagenese zeigen wir, dass Hyperforin den Kanal über ein spezifisches Bindungsmotiv an TRPC6 aktiviert. Wir haben eine Analyse der Hyperforin-Wirkung durchgeführt, um ein neues Antidepressivum zu entwickeln, das für seine antidepressive Wirkung denselben TRPC6-Zielmechanismus nutzt. Wir haben das Hyperforin-Analogon Hyp13 synthetisiert, das eine ähnliche Bindung an TRPC6 zeigt und TRPC6-abhängige anxiolytische und antidepressive Wirkungen bei Mäusen rekapituliert. Hyp13 aktiviert den Pregnan-X-Rezeptor (PXR) nicht und verliert dadurch das Potenzial, Wechselwirkungen zwischen Arzneimitteln auszulösen. Dies könnte einen neuen Ansatz zur Entwicklung besserer Behandlungsmöglichkeiten für Depressionen darstellen, da Depressionen nach wie vor eine der behandlungsresistentesten psychischen Störungen sind und die Entwicklung wirksamer Medikamente auf der Basis natürlich vorkommender Verbindungen rechtfertigen.

Depression ist eine schwere psychische Störung mit einer Lebenszeitprävalenz von mehr als 10 % [1]. Zusätzlich zur depressiven Verstimmung treten Symptome wie Interessenverlust, Anhedonie, Ängste, Gefühle der Wertlosigkeit, Gewichtsverlust, Schlaflosigkeit und Konzentrationsdefizite auf [2, 3]. In der täglichen medizinischen Praxis werden zur Behandlung depressiver Patienten verschiedene Antidepressiva wie selektive Serotonin-Aufnahmehemmer (SSRI) oder trizyklische Medikamente eingesetzt [2]. Allerdings leiden die Patienten unter mehreren langanhaltenden und die Therapietreue beeinträchtigenden Nebenwirkungen wie Gewichtszunahme oder sexueller Dysfunktion oder zeigen eine teilweise oder gar keine Reaktion auf klassische Antidepressiva.

Patienten mit leichten bis mittelschweren Depressionen begrüßen pflanzliche Antidepressiva wie Johanniskraut, da sie weniger Nebenwirkungen haben als häufig verschriebene synthetische Antidepressiva. Das pflanzliche Antidepressivum Johanniskraut wird seit Jahrhunderten zur Behandlung leichter bis mittelschwerer Depressionen eingesetzt [4,5,6]. Hyperforin, der Hauptbestandteil des Antidepressivums, ist ein acyliertes bicyclisches Phloroglucinol-Derivat mit geringen strukturellen und funktionellen Ähnlichkeiten mit bekannten therapeutisch eingesetzten Antidepressiva. Der antidepressive Wirkmechanismus von Hyperforin wird intensiv diskutiert [7]. Es wurde vorgeschlagen, dass Hyperforin in heterologen Expressionssystemen und nicht-neuronalen Zellen als Protonophor in äußeren und inneren Zellmembranen wirkt und dadurch die Aufnahme und vesikuläre Speicherung verschiedener Neurotransmitter, einschließlich Monoaminen, behindert [8]. Im Gegensatz dazu haben wir gezeigt, dass Hyperforin die Kanäle des transienten Rezeptorpotentialkanals 6 (TRPC6) aktiviert, und die Hypothese aufgestellt, dass dieser Effekt für sein antidepressives Profil wesentlich ist [9, 10]. TRPC6 ist ein Mitglied der TRP-Superfamilie. TRP-Kanäle sind Homo- und/oder Heterotetramere von Untereinheiten, die sechs Transmembransegmente (S1–S6) und zytoplasmatische N- und C-terminale Schwänze enthalten [11]. S5, S6 und die verbindende Porenschleife bilden die kationenleitende Pore. S1–S4 und die zytoplasmatischen N- und C-Termini sind wichtig für das Channel-Gating und die Interaktion mit Liganden oder Proteinen [12,13,14,15,16]. Die menschliche TRPC-Unterfamilie umfasst sieben Mitglieder, TRPC1 bis TRPC7 (15, 17). Für verschiedene TRPC-Kanäle, einschließlich TRPC6, wurden kürzlich Kryo-EM-Strukturen veröffentlicht, z. B. [18,19,20]. Allerdings wurden hochflexible Regionen im C-Terminus, die zu Konformationsänderungen während der Aktivierung beitragen könnten, nicht aufgelöst [19,20,21,22]. Wichtig ist, dass Hyperforin nur TRPC6-Kanäle aktiviert und nicht die eng verwandten TRPC3- und TRPC7-Kanäle [9].

TRPC6-Kanäle werden in mehreren für Depressionen relevanten Hirnregionen exprimiert, beispielsweise im Gyrus dentatus, wo die Kanalexpression besonders ausgeprägt ist, sowie in kortikalen Regionen [23,24,25,26,27]. Wir und andere haben gezeigt, dass TRPC6-Kanäle an Veränderungen der synaptischen Plastizität beteiligt sind, die vom Dendritenwachstum über Veränderungen der Wirbelsäulenmorphologie bis hin zur Zunahme erregender Synapsen reichen [25, 28]. Hyperforin wirkt als Mimetikum des aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktors (BDNF) in Neuronen des Hippocampus und verändert die Morphologie der dendritischen Wirbelsäule über TRPC6-Kanäle [24]. Allerdings ist Hyperforin unter Einwirkung von Licht und Sauerstoff nicht stabil [29]. Aufgrund der starken Aktivierung des Kernrezeptors PXR (NR1I2), einem wichtigen Transkriptionsregulator von Genen, die am Metabolismus und Transport von Arzneimitteln beteiligt sind, induziert es auch Wechselwirkungen zwischen Arzneimitteln [30]. Diese Merkmale schränken die klinische Anwendung ein und erfordern die Weiterentwicklung therapeutisch anwendbarer Antidepressiva.

Mithilfe einer Kombination aus Verhaltensanalysen, Elektrophysiologie, ortsgerichteter Mutagenese und chemischer Synthese zeigen wir hier, dass TRPC6-Knockout-Mäuse (KO) depressives und ängstliches Verhalten zeigen. Damit einher geht eine verminderte Aktivität von Körnerzellen im Gyrus dentatus und Pyramidenneuronen in der CA1-Region des Hippocampus als potenzieller depressogener Mechanismus. Wir identifizieren einen Aminosäureabschnitt innerhalb des zytoplasmatischen C-Terminus, der für die direkte Interaktion von Hyperforin mit TRPC6 essentiell ist. Basierend auf diesen Erkenntnissen haben wir das Hyperforin-Analogon Hyp13 synthetisiert, bei dem es sich um ein chemisch vereinfachtes Phloroglucinol handelt. Wir zeigen, dass Hyp13 TRPC6-abhängige antidepressive Wirkungen hat. Darüber hinaus aktiviert Hyp13 weder PXR noch induziert es CYP3A4. Unsere Ergebnisse unterstreichen die entscheidende Rolle von TRPC6-Kanälen bei Depressionen und Angstzuständen. Daher schlagen wir TRPC6 als neues Wirkstoffziel für die Antidepressivumtherapie vor.

Um eine Beteiligung von TRPC6 an Depressionen und Angstzuständen zu testen, verwenden wir ein TRPC6-KO-Mausmodell [31]. Männliche TRPC6-KO-Mäuse zeigen im Freilandtest und im erhöhten Plus-Labyrinth-Test ängstliches Verhalten. Im Freilandtest zeigen TRPC6-KO-Mäuse im Vergleich eine signifikant verkürzte Zentrumszeit (Abb. 1A), eine verringerte Anzahl von Zentrumeintrittszeiten (Abb. 1B), eine verminderte Zentrumsbewegungszeit (Abb. 1C) und eine periphere Fortbewegungszeit (Abb. 1D). an Wildtyp-Mäuse (WT-Mäuse). Im EPM-Test (Elevated Plus Maze) verbringen TRPC6-KO-Mäuse im Vergleich zu WT-Tieren deutlich mehr Zeit im geschlossenen Arm (CA) (Abb. 1E). Die Armbewegung im geschlossenen Arm und in der Mitte des Labyrinths ist bei den TRPC6-KO-Mäusen deutlich reduziert (Abb. 1F). Im Forced Swim Test (FST) zeichnen sich die TRPC6 KO-Mäuse durch eine deutlich verlängerte Immobilitätszeit aus (Abb. 1G). Im Saccharose-Präferenztest (SPT), der Anhedonie widerspiegelt, zeigen TRPC6-KO-Mäuse im Vergleich zur Zeit der WT-Tiere eine verringerte Saccharose-Präferenz (Abb. 1H). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse einen klaren depressiven/ängstlichen Phänotyp bei Mäusen, denen TRPC6 fehlt.

A–D-Verhalten im Freilandtest. E, F Verhalten im erhöhten Plus-Labyrinth-Test (OA offener Arm, CA geschlossener Arm, Ctr-Mitte). G Verhalten im Zwangsschwimmtest. H Saccharose-Präferenztest. Die Daten werden als Mittelwerte ± SEM ausgedrückt (n = 14 pro Gruppe; *p < 0,05, **/#P < 0,001, ***/$P < 0,001 vs. WT).

Der Hippocampus ist eine Schlüsselstruktur für die emotionale Regulierung, die zu Depressionen und Angststörungen führen kann [32,33,34,35,36]. Um ein mögliches neuronales Korrelat für Depressions- und Angstverhalten bei TRPC6-KO-Mäusen zu identifizieren, untersuchen wir die neuronale Erregbarkeit von DG und CA1 in akuten Hippocampusschnitten von WT- und KO-Mäusen mithilfe von Ganzzell-Stromklemmenaufzeichnungen. Ein vergleichbares Ruhemembranpotential (RMP) wird in WT- und TPRC6-KO-CA1-Pyramidenzellen beobachtet (WT, –72,9 ± 0,8 mV, n = 14 von 9 Mäusen; TRPC6-KO, –74,3 ± 0,9 mV, n = 18 von 6 Mäusen, p = 0,26) und DG-Körnerzellen (WT, −86,0 ± 0,5 mV, n = 25 von 15 Mäusen; TRPC6-KO, −86,3 ± 0,5 mV, n = 29 von 8 Mäusen, p = 0,70). Im Vergleich zu ihren WT-Gegenstücken haben TRPC6-KO-Granulatzellen einen geringeren Membraneingangswiderstand (RN; bei –70 mV: WT, 325,0 ± 10,9 MΩ; TRPC6 KO, 288,9 ± 10,8 MΩ; p = 0,02), während zwischen ihnen kein signifikanter Unterschied besteht WT und mutierte CA1-Pyramidenzellen (WT, 194,1 ± 9,4 MΩ; TRPC6 KO, 204,4 ± 12,3 MΩ; p = 0,53). Um die zellulären Feuereigenschaften zu untersuchen, rufen wir Aktionspotentiale (APs) mit einer depolarisierenden Stromrampe (0–100 pA über 2 s) hervor, beginnend mit dem RMP der Neuronen oder, zum besseren Vergleich zwischen Gruppen, mit einem Membranpotential von –70 mV. die durch Stromeinspeisung eingestellt wird. Wie die repräsentativen Spannungskurven in Abb. 2A zeigen, die von einer WT- und einer TRPC6-KO-CA1-Pyramidenzelle erhalten wurden, verringert eine genetische Störung von trpc6 die Feuerungsneigung, sodass im Vergleich zum WT-Neuron weniger APs pro Rampendepolarisation abgefeuert werden. Sowohl CA1-Pyramidenzellen als auch DG-Körnerzellen von TRPC6-KO-Mäusen zeigen ein deutlich abgeschwächtes Entladungsmuster, unabhängig davon, ob das Feuern im Ruhezustand oder bei –70 mV ausgelöst wird (Abb. 2B). Umgekehrt ist Rheobase, der minimale Strom, der erforderlich ist, um den ersten AP während der Rampendepolarisation zu induzieren, in DG-Körnerzellen und CA1-Neuronen von TRPC6-KO-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen deutlich erhöht (Abb. 2C). Diese Daten zeigen, dass der konstitutive Verlust der TRPC6-Funktion dauerhafte Veränderungen der grundlegenden Feuereigenschaften von DG- und CA1-Neuronen zur Folge hat.

Ganzzellige Stromklemmenaufzeichnungen wurden an Hippocampus-CA1-Pyramidenzellen und Granulatzellen des Gyrus dentatus bei der Präparation von Hirnschnitten durchgeführt. Aktionspotentiale (APs) wurden mit einem depolarisierenden Rampenimpuls von 0 auf 100 pA für 2 s vom Ruhemembranpotential (RMP) oder –70 mV (angepasst durch Strominjektion) hervorgerufen. Spannungsspuren von CA-Pyramidenzellen aus einem WT- und einem TRPC6-KO-Schnitt veranschaulichen die hervorgerufenen APs. Die gestrichelte Linie zeigt −70 mV und die grauen Linien unten zeigen das Rampenprotokoll. Histogramme fassen die Anzahl der APs pro Rampe (B) und die Rheobase (der minimale Strom, der erforderlich ist, um den ersten AP auszulösen; C in WT- und TRPC6-KO-Hippocampuszellen) zusammen. *p < 0,05; **p < 0,01.

Als nächstes untersuchen wir die Wirkung von Hyperforin auf die Erregbarkeit von DG-Körnerzellen und die Rolle von TRPC6 darin, wobei wir dasselbe Rampendepolarisationsprotokoll wie oben verwenden. In WT-Körnerzellen führt die Badanwendung von Hyperforin (3 µM) zu einer zweiphasigen Reaktion, bei der auf einen vorübergehenden Anstieg der Erregbarkeit eine starke Hemmung des AP-Feuerns folgt (Abb. 3A, obere Spuren Abb. 3C, n = 8 von 7 Mäusen). ., Die entsprechende Trajektorie des Membranpotentials zeigt eine anfängliche kleine Depolarisation und eine anschließende ausgeprägte Hyperpolarisation, die über die Zeit der Arzneimittelanwendung hinaus anhält (Abb. 3B). Im Gegensatz dazu kann Hyperforin TRPC6-defiziente Neuronen nicht anregen, während die Hemmwirkung des Arzneimittels unbeeinflusst bleibt (Abb. 3A, untere Spuren; Abb. 3C, n = 5 von 5 Mäusen). Um eine mögliche synaptische Wirkung von Hyperforin auf die Erregbarkeit der Zellen auszuschließen, isolieren wir die aufgezeichneten Zellen funktionell von erregenden und hemmenden Eingaben in WT-Schnitten mit Antagonisten für die ionotropen Glutamatrezeptoren (Kynurensäure; 2 mM) und GABAA-Rezeptoren (Pikrotoxin, 100 µM). und beobachten Sie ähnliche zweiphasige Reaktionen bei Hyperforin-Anwendung (Abb. 3C, n = 6 von 4 Mäusen). Während der frühen Erregungsphase steigt der RN von 240,0 ± 10,4 MΩ unter Kontrollbedingungen auf 257,8 ± 8,6 MΩ (p = 0,046) und fällt dann während der Hemmphase auf 160,5 ± 12,5 MΩ ab (n = 6 von 4 Mäusen, p = 0,002). ). Aus diesen Erkenntnissen wird deutlich, dass Hyperforin erstens die Anwesenheit von TRPC6 benötigt, um Körnerzellen anzuregen und deren Zündung zu fördern, und zweitens, dass die verzögerte Hemmwirkung von Hyperforin nicht von der vorherigen Aktivierung von TRPC6 abhängt. Bei der Aufzeichnung in WT-Körnerzellen, die in Gegenwart von TTX (1 µM) einer Spannungsklemme bei –70 mV ausgesetzt waren, um APs zu blockieren, ruft Hyperforin (3–10 µM) einen nach innen gerichteten Strom von –8,0 ± 1,4 pA hervor (n = 10 von 6). Mäuse), worauf ein Auswärtsstrom folgt, während in TRPC6-defizienten Körnerzellen die Einwärtsstromreaktion auf Hyperforin aufgehoben wird (Abb. 3D, n = 7 von 3 Mäusen). Der Hyperforin-induzierte Auswärtsstrom, der in WT- und TRPC6-KO-Neuronen gleichermaßen vorhanden ist, wird wahrscheinlich durch K+-Kanäle vermittelt, da er stark reduziert wird, wenn wir K+ in der Pipettenlösung durch Cs+ ersetzen (n = 10 aus 4-wt-Mäusen; n = 6). von 3 TRPC6 KO-Mäusen; Abb. 3E). Die genaue Charakterisierung des Auswärtsstroms und seine mögliche Auswirkung auf die antidepressive Wirkung von Hyperforin müssen noch weiter untersucht werden. Es können jedoch eindeutige Schlussfolgerungen hinsichtlich des umstrittenen ionischen Mechanismus des Hyperforin-vermittelten Einwärtsstroms gezogen werden. Neben TRPC6-Kanälen [24] wurden auch Anionenkanäle [37] und Protonenkanäle [8] als Ursache für diesen Strom vorgeschlagen. Unsere Daten sprechen nun eindeutig für TRPC6. Darüber hinaus legen sie nahe, dass die selektive pharmakologische Aktivierung von TRPC6 ein vielversprechender Ansatz zur Korrektur des abweichenden Feuerungsmusters von Hippocampus-Neuronen sein könnte, das mit Depressionsverhalten verbunden ist.

A–C Ganzzell-Stromklemmenaufzeichnungen von Körnerzellen zeigen Auswirkungen von Hyperforin (3 µM) auf evozierte APs (A, C) und auf das Membranpotential (B). Gestrichelte Linien zeigen –70 mV an, die Depolarisationsrampe betrug 0–70 pA für WT-Körnerzellen und 0–100 pA für TRPC6-KO-Zellen. Die durch Hyperforin induzierte biphasische Reaktion in wt-Schnitten blieb erhalten, nachdem die schnelle synaptische Übertragung mit Kynurensäure (KA) und Picrotoxin (PTX) blockiert wurde (C). D, E Spannungsklemmenaufzeichnungen (gehalten bei –70 mV) veranschaulichen den Verlust des Hyperforin-induzierten anfänglichen Einwärtsstroms in Neuronen von TRPC6-KO-Mäusen (D). Der verbleibende Auswärtsstrom betrifft K+-Kanäle, wie durch den Stromverlust mit CsGlu-gefüllter Pipette (E) angezeigt. ***p < 0,001.

Nachdem wir gezeigt haben, dass der durch Hyperforin initiierte Einwärtsstrom bei TRPC6-KO-Mäusen verloren geht, fragen wir, ob Hyperforin direkt an TRPC6 bindet. Wir haben zuvor gezeigt, dass Hyperforin nur menschliche TRPC6-Kanäle (hTRPC6) aktiviert (Topologiemodell, Abb. 4A), aber keine stimulierende Wirkung auf die phylogenetisch eng verwandten hTRPC3- und hTRPC7-Kanäle in derselben Untergruppe oder tatsächlich auf andere hTRPC-Kanäle zeigt [9]. Um dies für die Identifizierung von Aminosäuren zu nutzen, die für die Hyperforin-abhängige TRPC6-Aktivierung relevant sind, mutieren wir Reste, die sich zwischen hTRPC6 und hTRPC3/TRPC7 unterscheiden (Ergänzung 1, Sequenzausrichtung) [3]. Diese mutierten hTRPC6-Proteine ​​werden in HEK293-Zellen als C-terminale YFP-Fusionsproteine ​​exprimiert, um die Expression und zelluläre Lokalisierung zu kontrollieren. Die Proteinexpression wird mittels Western-Blot-Analyse und Fluoreszenzmikroskopie überprüft und zeigt, dass keine Unterschiede zwischen hTRPC6 und mutiertem TRPC6 gefunden werden (ergänzende Abbildung 2). Um die Funktionalität zu testen, werden Einzelzell-Kalziummessungen mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 unter Anwendung von OAG oder SAG, Analoga des endogenen unselektiven TRPC3/6/7-Aktivators Diacylglycerol, durchgeführt [38]. Für Calcium-Imaging-Experimente verwenden wir OAG (100 µM) und wenden es vor der Anwendung von Hyperforin (10 µM) an. In TRPC6-exprimierenden Zellen führt die Anwendung von OAG zu einem schnellen Anstieg von [Ca2+]i, der sich in einem Anstieg des Fura-2-Verhältnisses widerspiegelt. Die anschließende Anwendung von Hyperforin führt zu einer Reaktion mit vergleichbarem Anstieg von [Ca2+]i. Um zu sehen, ob die TRPC6-Mutanten unterschiedlich auf Hyperforin reagieren, werden sie zusätzlich mit OAG (100 µM) und Hyperforin (10 µM) stimuliert (siehe Ergänzung 1-Alignment mit allen untersuchten Mutanten). Wichtig ist, dass wir eine TRPC6-Mutante identifizieren, die immer noch einen durch OAG (100 µM) induzierten schnellen Anstieg des Fura-2-Verhältnisses zeigte, aber nicht auf Hyperforin (10 µM) reagierte (Abb. 4B, D). Hier werden die Aminosäuren 777LLKL780 im C-terminalen Bereich von hTRPC6 durch die entsprechenden Aminosäuren 708IMRI711 von hTRPC3 und hTRPC7 (722IMRI725) ersetzt (Topologiemodell, Abb. 4A).

A Das Topologiemodell von menschlichem TRPC6 (hTRPC6) zeigt α-Helices in Zylindern und gestrichelte Linien beschreiben Bereiche mit nicht ausreichender Dichte in der CryoEM-Struktur PDB: 6uz8. Potenzielle Hyperforin-Bindungsstellen sind mit einem roten Stern markiert. B Skizze, die zeigt, dass die Aminosäuren LLKL in hTRPC6 in die entsprechenden Aminosäuren IMRI von hTRPC3 mutiert wurden, um die Hyperforin-vermittelte TRPC6-Aktivierung zu blockieren. In einem zweiten Schritt wurden die Aminosäuren IMRI in hTRPC3 in die entsprechenden Aminosäuren LLKL von hTRPC3 mutiert, um einen Hyperforin-sensitiven hTRPC3-Kanal zu induzieren. hTRPC6 (schwarz), TRPC6mut = IMRITRPC6mut (rot), hTRPC3 (grau), TRPC3mut = LLKLTRPC3mut. C Einzelzell-Ca2+-Bildgebung wurde in HEK293-Zellen durchgeführt, die transient den pcDNA3.1-Plasmidvektor exprimierten, wobei die DNA nur für eYFP (ctl, weiß), hTRPC6 (schwarz), hTRPC6mut (rot), hTRPC3 (grau) oder hTRPC3mut (blau) kodierte. alle werden als C-terminale eYFP-Fusionsproteine ​​ausgedrückt. Die Zellen wurden mit dem Lösungsmittel DMSO (0,1 %), OAG (100 µM) oder Hyperforin (10 µM) stimuliert und intrazelluläre Ca2+-Veränderungen wurden mit Fura-2 AM (n = 7–9 ± SEM) nachgewiesen, Zellen wurden nach ihrem eYFP ausgewählt Fluoreszenz und ihre OAG-Empfindlichkeit; Die statistische Signifikanz wurde durch ANOVA mit Post-hoc-Dunnett-Test analysiert. ***p < 0,001) C Ganzzellströme wurden von HEK293-Zellen aufgezeichnet, die vorübergehend eYFP (ctl, weiß), hTRPC6 (schwarz), hTRPC6mut exprimierten ( rot), hTRPC3 (grau) oder hTRPC3mut (blau), alle ausgedrückt als C-terminale eYFP-Fusionsproteine. Die mittleren Stromdichten sind bei +100 und –100 mV nach Anwendung von Hyperforin (10 µM) dargestellt. Die Ströme wurden auf die Grundströme normiert, bevor die Wirkstoffanwendung subtrahiert wurde (n = 3 ± SEM¸. Die statistische Signifikanz wurde durch ANOVA mit Post-hoc-Dunnett-Test ***p < 0,001 analysiert). D Repräsentative Zeitspuren wurden in HEK293-ctl-Zellen (gestrichelte Linie), hTRPC6-exprimierenden HEK293-Zellen (schwarz) oder hTRPC6mut (rot), stimuliert mit OAG (100 µM), 60 s nach Beginn des Experiments und nach 300 s Hyperforin (10 µM) überwacht. angewendet wurde. E Repräsentative Zeitspuren wurden in HEK293-ctl-Zellen (gestrichelte Linie), hTRPC3-exprimierenden HEK293-Zellen (grau) oder hTRPC3mut (blau), stimuliert mit OAG (100 µM), 60 s nach Beginn des Experiments und nach 300 s Hyperforin (10 µM) überwacht. angewendet wurde. F Ganzzellströme, aufgezeichnet von HEK293-ctl-Zellen (gestrichelte Linie), hTRPC6-exprimierenden HEK293-Zellen (schwarz) oder hTRPC6mut (rot). Die Anwendung von Hyperforin (10 µM) führte zu einem Anstieg des nach außen und innen gerichteten Stroms in hTRPC6-exprimierenden Zellen. Dieser Effekt geht in TRPC6mut-exprimierenden Zellen verloren. G Ganzzellströme, aufgezeichnet von HEK293-ctl-Zellen (gestrichelte Linie), hTRPC3-exprimierenden HEK293-Zellen (grau) oder hTRPC3mut (blau). Die Anwendung von Hyperforin (10 µM) zeigte keine Wirkung auf ctl- und hTRPC3-exprimierende Zellen, führte jedoch zu einem Anstieg des nach außen und innen gerichteten Stroms in hTRPC3mut-exprimierenden Zellen. H Die Hyperforin-Bindungsstelle LLKL am menschlichen hTRPC6 unterscheidet sich in der letzten Aminosäure vom Ratten- und Maus-TRPC6 LLKF. Um zu testen, ob diese Aminosäure die Bindung von Hyperforin an TRPC6 beeinträchtigt, haben wir hTRPC6 mit hTRPC6 LLKF verglichen. Die Einzelzell-Kalziumbildgebung wurde in HEK239-Zellen durchgeführt, die vorübergehend hTRPC6 oder hTRPC6 LLKF exprimierten. Die Zellen wurden mit Hyperforin (10 µM) stimuliert und Änderungen des Fura-2-AM 340/380 nm-Verhältnisses wurden analysiert und anschließend in intrazelluläres Ca2+ in nM umgewandelt. Es wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet (n = 3 ± SEM, Zellen wurden anhand ihrer eYFP-Fluoreszenz ausgewählt; die statistische Signifikanz wurde mithilfe des ungepaarten t-Tests berechnet, nicht signifikant 0,0576).

Um das LLKL-Motiv im TRPC6-C-Terminus als mutmaßliche Bindungsstelle von Hyperforin weiter zu charakterisieren, testen wir die hTRPC6-Mutante in elektrophysiologischen Aufzeichnungen. Ganzzellaufzeichnungen von hTRPC6-exprimierenden HEK293-Zellen führen zu Strom-Spannungs-Beziehungen, die mit früheren Daten vergleichbar sind (Abb. 4C, F). In extrazellulären Standardlösungen hat die Strom-Spannungs-Beziehung des SAG-Stroms (Ergänzende Abbildungen 3A, B und 2C), gemessen anhand von Spannungsrampen, eine nach außen gleichrichtende Form, vergleichbar mit den Kurven, die sich aus der Anwendung von Hyperforin ergeben (Abb. 4F). . Hyperforin zeigt keine Wirkung auf nicht transfizierte HEK293-Zellen (Abb. 4F). Der hTRPC6 708IMRI711-Mutant weist weiterhin die Eigenschaften der Strom-Spannungs-Beziehung des SAG-Stroms auf (ergänzende Abbildung 3B, C), reagiert jedoch nicht auf Hyperforin (10 µM) (Abb. 4C, F).

Da TRPC6 und TRPC3 strukturelle und sequentielle Homologie aufweisen, haben wir uns gefragt, ob TRPC3, das normalerweise nicht auf Hyperforin reagiert, durch Transplantation des LLKL-Motivs von TRPC6 in TRPC3 für diese Verbindung sensibilisiert werden kann. Wie erwartet kann WT hTRPC3 weder in Einzelzell-Calcium-Bildgebungsexperimenten noch in Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen durch Hyperforin aktiviert werden. Die Zugabe von OAG (100 µM) führt zu einem starken Ca2+-Einstrom in HEK-Zellen, die vorübergehend hTRPC3 exprimieren (Abb. 4B, G). Im Gegensatz dazu induziert Hyperforin einen nach innen gerichteten Strom in der hTRPC3-Mutante, die das LLKL-Bindungsmotiv trägt (Abb. 4C, G), was zeigt, dass dieses Motiv notwendig und ausreichend ist, um TRPC3 oder TRPC6 Hyperforin-Empfindlichkeit zu verleihen.

Da unsere Verhaltensexperimente an Mäusen durchgeführt wurden, untersuchen wir die in Abb. 4H gezeigte Hyperforin-vermittelte Aktivierung von murinem TRPC6 weiter, um die oben beschriebenen zellbasierten Daten zu menschlichem hTRPC6 zu ergänzen. In Patch-Clamp- und Einzelzell-Calcium-Imaging-Experimenten konnten wir bisher keine offensichtlichen Unterschiede zwischen den Hyperforin-vermittelten Auswärtsströmen oder dem Ca2+-Einstrom bei den beiden Arten feststellen. Allerdings ist die letzte Aminosäure des menschlichen TRPC6-Hyperforin-Bindungsmotivs LLKL in murinem TRPC6 zu LLKF verändert (siehe ergänzende Abbildungen 1 und 4H). Wir prüfen daher, ob eine Leucin-zu-Phenylalanin-Substitution im menschlichen TRPC6-Kanal die Hyperforin-Aktivierung beeinflusst. Unter Verwendung von HEK293-Zellen, die vorübergehend die hTRPC6-LLKF-Mutante exprimieren, beobachten wir bei Einzelzell-Kalzium-Bildgebungsexperimenten im Vergleich zu WT-hTRPC6 nur geringfügige Veränderungen (Abb. 4H). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die letzte Aminosäure des LLKL-Bindungsmotivs möglicherweise nur eine untergeordnete Rolle bei der Hyperforin-vermittelten hTRPC6-Aktivierung spielt.

Die Bindungsstelle von Hyperforin innerhalb des hTRPC6-C-Terminus, das 777LLKL780-Motiv, ist intrazellulär in einer Region des Kanals (Reste 768–853) lokalisiert, die in den berichteten Kryo-EM-Strukturen von hTRPC6 nicht aufgelöst ist (Abb. 4 Topologiemodell) [ 19, 20]. Daher wird vermutet, dass diese Strukturen ungeordnet oder hochflexibel sind. Um die Gesamtsekundärstruktur des C-terminalen Peptids von TRPC6 zu identifizieren und mögliche strukturelle Veränderungen bei Hyperforin-Wechselwirkung zu untersuchen, haben wir CD-Spektren isolierter Peptide gemessen, die das 777LLKL780-Motiv oder seinen mutierten 777IMRI780-Abschnitt tragen (Abb. 5A, C). Das TRPC6-Peptid weist in Abwesenheit und Anwesenheit von Hyperforin (5 µM) eine α-helikale Struktur auf (Abb. 5A), es werden jedoch keine Veränderungen der gesamten Sekundärstruktur als Reaktion auf steigende Hyperforinkonzentrationen beobachtet. Aufgrund der Interferenz von Hyperforin mit dem zirkulierenden Licht ist die Zugabe von Hyperforin in Konzentrationen über 5 µM nicht möglich. Dieses C-terminale Peptid von TRPC6 enthält zahlreiche hydrophobe Reste, was darauf hindeuten könnte, dass es mit Lipiden interagieren kann. Daher überwachen wir die Interaktion des TRPC6-C-Terminus und seines Mutanten mit Lipidmembranen, den Einfluss von Hyperforin auf diese Interaktion und ob Hyperforin direkt mit der isolierten C-terminalen Region von TRPC6 interagiert (Abb. 5), indem wir entweder die Membran- Der durchlässige Fluoreszenzfarbstoff Laurdan (Abb. 5B), der die Wasserzugänglichkeit überwacht und somit als Stellvertreter für die Membranfluidität fungiert [39], oder der native Tryptophanrest W783 der Peptide für Fluoreszenzmessungen (Abb. 5D–F).

CD-Spektren von Wildtyp-TRPC6-Peptiden in Abwesenheit und Gegenwart von Hyperforin (A). Laurdan-Fluoreszenzmessung zur Überwachung von Membranfluiditätsänderungen, die durch Hyperforin (weiße Balken), TRPC6-Peptid (schwarze Balken) und TRPC6mut-Peptid (rote Balken) verursacht werden (B). Aminosäuresequenzen von TRPC6 und TRPC6mut sind in (C) dargestellt. Unterschiede zwischen den beiden Sequenzen sind unterstrichen. Tryptophan-Fluoreszenz unter Verwendung des Rests W782 als Reporter von TRPC6 (D) und TRPC6mut, titriert mit Hyperforin (E). Fluoreszenzmaxima (vertikale schwarze Linie in D und E) wurden gegen die Hyperforinkonzentration geblottet und gegen Fluoreszenzmaxima ohne Hyperforin (F) normalisiert.

Die Laurdan-Fluoreszenzmessung ist ein Werkzeug zur Überwachung von Fluiditätsänderungen in Liposomen oder Membranen. Generalisierte Polarisationswerte (GP) von POPC-POPG-Liposomen mit Laurdan wurden nach Zugabe von Hyperforin und in Gegenwart von zwei Peptiden aufgezeichnet, die eine native C-terminale Region von TRPC6 darstellen, die das LLKL-Motiv oder die entsprechenden Reste 708IMRI711 von TRPC3 beherbergt (Abb. 5C). , TRPC6mut). In Gegenwart von bis zu 10 µM Hyperforin ändern sich die ΔGP-Werte der POPC-POPG-Liposomen nicht (Abb. 5B, weiße Balken). Daher hat Hyperforin unter diesen Bedingungen keinen alleinigen Einfluss auf die Membranfluidität. Im Gegensatz dazu führt die Zugabe eines der beiden TRPC6-Peptide zu einem starken Anstieg der jeweiligen ΔGP-Werte, was auf eine durch die Peptidbindung verursachte Versteifung der Membran hinweist. Interessanterweise ist die Wirkung des mutierten TRPC6-Peptids weniger ausgeprägt als die des WT-Peptids (Abb. 5B, rote vs. schwarze Balken). Bei Zugabe von Hyperforin zum Liposom-Peptidkomplex steigt der ΔGP-Wert mit dem WT-TRPC6-Peptid noch mehr an, während die ΔGP-Werte mit TRPC6mut stabil bleiben. Somit führen WT TRPC6-Peptid und Hyperforin synergistisch zu einer verringerten Membranflüssigkeit bereits bei niedrigen Hyperforinkonzentrationen. Um zu untersuchen, ob Hyperforin direkt mit den Peptiden interagieren kann, nutzen wir Tryptophan-Fluoreszenz, indem wir den einzigen nativen Tryptophan-Rest, W783, nutzen, der sich neben der vorgeschlagenen Hyperforin-Bindungsstelle befindet. Die Tryptophan-Fluoreszenz reagiert sehr empfindlich auf Veränderungen in der Umgebung, wie z. B. Hydrophobie, und kann daher über die Ligandenbindung berichten. Bei der Titration von Hyperforin auf die beiden TRPC6-Peptide wird eine Abnahme der Fluoreszenzintensität beobachtet (Abb. 5D – F). Wichtig ist, dass das TRPC6mut-Peptid eine deutlich verringerte Interaktion mit Hyperforin zeigt, was darauf hindeutet, dass das LLKL-Motiv tatsächlich eine wichtige Rolle bei der Hyperforin-Interaktion spielt.

Hyperforin (Abb. 6A) ist ein polyprenyliertes bicyclisches Acylphloroglucinol-Derivat, das bei Einwirkung von Licht und Sauerstoff nicht sehr stabil ist und Arzneimittelwechselwirkungen induziert [30]. Daher haben wir zuvor vereinfachte 2,4-Diacylphloroglucinole hergestellt, die chemisch stabil sind und eine ähnliche Aktivität und Selektivität für TRPC6 zeigen, aber PXR nicht aktivieren [30]. Hier charakterisieren wir die Auswirkungen eines neuen Phloroglucinol-Derivats, Hyp13 (Abb. 6B), auf TRPC6-vermittelte Einwärtsströme in HEK293-Zellen, die vorübergehend TRPC6-Kanäle exprimieren. Die Strom-Spannungs-Beziehung des Hyp13-induzierten Stroms, gemessen an Spannungsrampen, hat eine nach außen gleichrichtende Form, vergleichbar mit den Kurven, die sich aus der Anwendung von Hyperforin ergeben (Abb. 6C). Hyp13 (10 µM) ist selektiv für TRPC6 (Abb. 6D) und aktiviert TRPC3 nicht (Abb. 6E). In HEK293-Zellen, die hTRPC6 vorübergehend exprimieren, induziert Hyp13 (10 µM) in Einzelzell-Kalziumexperimenten einen starken und vorübergehenden Ca2+-Zustrom (Abb. 6D, E), der mit den Wirkungen von Hyperforin vergleichbar ist. In hTRPC3-exprimierenden HEK293-Zellen löst Hyp13 (10 µM) ähnlich wie Hyperforin (10 µM) in Einzelzell-Kalzium-Bildgebungsexperimenten keinen Ca2+-Einstrom aus (Abb. 6D, F). In Ganzzell-Patch-Clamp-Experimenten in hTRPC6-exprimierenden HEK293-Zellen initiiert Hyp13 (10 µM) einen nach außen gerichteten Gleichrichtungsstrom (Abb. 6G), der mit den Wirkungen von Hyperforin (10 µM) vergleichbar ist. Hyp13 (10 µM) zeigt keine Auswirkungen auf hTRPC3-exprimierende HEK293-Zellen (Abb. 6D, H). Darüber hinaus geht der Hyp13-induzierte Ca2+-Zustrom (Abb. 6D, E) und der nach außen gerichtete Gleichrichtungskanal in HEK293-Zellen verloren, die vorübergehend die TRPC6-IMRI-Mutante exprimieren (Abb. 6G). Im Gegensatz dazu wird in HEK293-Zellen, die die TRPC3-LLKL-Mutante exprimieren, der durch Hyp13 induzierte Ca2+-Einstrom (Abb. 6D, F) und der nach außen gerichtete Gleichrichtungskanal wiederhergestellt (Abb. 6H). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Hyperforin und Hyp13 in hTRPC6 dieselbe Bindungsstelle haben.

Chemische Struktur von Hyperforin (A) und Hyp13 (B). Die Phloroglucinol-Kernstruktur ist rot hervorgehoben. (C) Konzentrationsabhängige Wirkung von Hyp13 in HEK293-Zellen, die hTRPC6-Kanäle in Ganzzell-Patch-Clamp-Experimenten exprimieren. D Hyp13 interagiert auch mit dem LLKL-Bindungsmotiv bei TRPC6. Die Einzelzell-Ca2+-Bildgebung wurde in HEK293-Zellen durchgeführt, die vorübergehend den pcDNA3.1-Plasmidvektor exprimierten, wobei die DNA nur für eYFP (ctl, weiß), hTRPC6 (schwarz), hTRPC6mut (rot), hTRPC3 (grau) oder hTRPC3mut (blau) kodierte ausgedrückt als C-terminale eYFP-Fusionsproteine. Die Zellen wurden mit Hyperforin (10 µM) oder Hyp13 (10 µM) stimuliert und intrazelluläre Ca2+-Veränderungen wurden mit Fura-2 AM nachgewiesen (n = 7–9 ± SEM, Zellen wurden nach ihrer eYFP-Fluoreszenz und ihrer OAG-Empfindlichkeit ausgewählt). E Repräsentative Zeitspuren wurden in HEK293-ctl-Zellen (gestrichelte Linie), hTRPC6-exprimierenden HEK293-Zellen (schwarz) oder hTRPC6mut (rot), stimuliert mit OAG (100 µM), 60 s nach Beginn des Experiments und nach 300 s Hyperforin (10 µM) überwacht. angewendet wurde. F Repräsentative Zeitspuren wurden in HEK293-ctl-Zellen (gestrichelte Linie), hTRPC3-exprimierenden HEK293-Zellen (grau) oder hTRPC3mut (blau), stimuliert mit OAG (100 µM), 60 s nach Beginn des Experiments und nach 300 s Hyperforin (10 µM) überwacht. angewendet wurde. G Ganzzellströme, aufgezeichnet von HEK293-ctl-Zellen (gestrichelte Linie), hTRPC6-exprimierenden HEK293-Zellen (schwarz) oder hTRPC6mut (rot). Die Anwendung von Hyp13 (10 µM) führte zu einem Anstieg des nach außen und innen gerichteten Stroms in hTRPC6-exprimierenden Zellen. Dieser Effekt geht in TRPC6mut-exprimierenden Zellen verloren. H Ganzzellströme, aufgezeichnet von HEK293-ctl-Zellen (gestrichelte Linie), hTRPC3-exprimierenden HEK293-Zellen (grau) oder hTRPC3mut (blau). Die Anwendung von Hyp13 (10 µM) zeigte keine Wirkung auf ctl- und hTRPC3-exprimierende Zellen, führte jedoch zu einem Anstieg des nach außen und innen gerichteten Stroms in hTRPC3mut-exprimierenden Zellen.

Um zu testen, ob die Arzneimittel-Wechselwirkungseigenschaften von Hyperforin auch in unserem neu charakterisierten Phlorogucinol-Derivat verloren gehen, untersuchten wir mithilfe eines GAL4-Fusionskonstrukt-basierten Assays, ob Hyp13 PXR aktiviert, um die Bindung einer Substanz an die PXR-Ligandenbindungsdomäne zu überwachen [ 40, 41]. Vor Beginn dieses Experiments untersuchten wir die Zytotoxizität von Hyp13 im Vergleich zu Hyperforin nach 24-stündiger Behandlung (ergänzende Abbildung 4). Hyp13 induzierte zytotoxische Wirkungen, die mit Hyperforin in HepG2- und HepaRG-Zellen vergleichbar waren. Wie bereits beschrieben, aktiviert Hyperforin PXR stark und konzentrationsabhängig, beispielsweise die bekannten PXR-Agonisten SR12813 und Rifampicin (Abb. 7A, ergänzende Abb. 4). Im Gegensatz dazu wurde nach der Behandlung mit Hyp13 nahezu keine Aktivierung beobachtet (Abb. 7A, ergänzende Abb. 4).

Induktion der PXR-Aktivität durch Hyperforin und sein Derivat in HepG2-Zellen (A). HepG2-Zellen wurden mit Plasmiden co-transfiziert, die GAL4-responsive UAS-gesteuerte Glühwürmchen-Luciferase, humanes PXR-LBD fusioniert mit GAL4-DBD und Renilla-Luciferase exprimierten. Die transfizierten Zellen wurden 10 µM der Positivkontrollen Rifampicin und SR12813 oder unterschiedlichen Konzentrationen von Hyperforin und seinem Derivat ausgesetzt. Nach 24 Stunden wurden die Zelllysate auf Glühwürmchen- und Renilla-Luciferase-Aktivität untersucht. Die Firefly-Luciferase-Aktivität wurde gegen die Renilla-Luciferase-Aktivität normalisiert und die fache Induktion relativ zur Lösungsmittelkontrolle (SC 0,5 % DMSO) wurde berechnet. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD von drei unabhängigen Experimenten dargestellt, die mit jeweils sechs Wiederholungen durchgeführt wurden. B Genexpressionsanalyse von CYP3A4. Differenzierte HepaRG-Zellen wurden 24 Stunden lang Hyperforin und seinem Derivat sowie 10 µM Rifampicin (PC) ausgesetzt. Die gesamte mRNA wurde isoliert und in cDNA transkribiert und anschließend wurde die mRNA-Expression von CYP3A4 durch Echtzeit-qPCR analysiert. Zur relativen Quantifizierung wurden die Ct-Werte gemäß der ΔΔCT-Methode auf Referenzgene (ACTB und GAPDH) normalisiert. Log2-fache Änderungen der 2−ΔΔCT-Werte wurden berechnet und die mRNA-Spiegel wurden im Verhältnis zur Lösungsmittelkontrolle (SC 0,5 % DMSO) ausgedrückt. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung von zwei bis drei unabhängigen Experimenten dargestellt.

Anschließend wurde die CYP3A4-mRNA-Expression analysiert (siehe Abb. 7B) und ergab eine starke Aktivierung von CYP3A4 durch Hyperforin in einem Ausmaß, das mit dem der Positivkontrolle Rifampicin vergleichbar war, wohingegen durch Hyp13 kein ausgeprägter Effekt verursacht wurde.

Am wichtigsten ist, dass wir testen, ob TRPC6-Kanäle für die Hyp13-vermittelten anxiolytischen und antidepressiven Wirkungen essentiell sind. Hyp13 zeigt antidepressive und anxiolytische Wirkungen bei männlichen B6J;129S8 WT-Mäusen in mehreren Tests, die auf Depressionen und Angstzustände hinweisen, wie dem Open-Field-Test (ergänzende Abbildung 5), der Neuheitsunterdrückungsfütterung (ergänzende Abbildung 6) oder dem Zwangsschwimmtest ( Ergänzende Abbildung 7). Wir konzentrieren uns auf ein Verhaltensparadigma, das bei männlichen TRPC6-KO-Mäusen stark beeinflusst wurde, den Freilandtest. Wir finden bei WT-Mäusen bei einer Konzentration von 5 mg/kg eine signifikant erhöhte Zentrumszeit, Zentrumsbewegung und Zentrumseintritte. Mit diesen Ergebnissen wenden wir Hyp13 (5 mg/kg) auf TRPC6-KO-Mäuse an und beobachten einen Verlust der anxiolytischen Wirkung von Hyp13 im Freilandtest im Vergleich zu WT-Mäusen (Abb. 8). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die emotionalen Wirkungen von Hyp13 TRPC6-abhängig sind.

Die anxiolytischen Wirkungen von Hyp13 (Hyp) sind TRPC6-abhängig. Anxiolytische Wirkungen wurden im Freifeldtest gezeigt, gemessen anhand der A-Zentrum-Zeit, der B-Zentrum-Eintritte und der C-Zentrum-Fortbewegung. TRPC6-Knockout-Mäuse (KO) zeigen diese Effekte nicht. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt (n = 11–12 pro Gruppe; *p < 0,05, **P < 0,001).

In dieser Studie charakterisieren wir die Rolle des TRPC6-Kanals für die antidepressive Wirkung von Hyperforin. Wir berichten, dass TRPC6-KO-Mäuse ein verstärktes depressions- und angstähnliches Verhalten zeigen. Ein wahrscheinlicher Mechanismus für diesen Phänotyp ist die beobachtete Veränderung der Erregbarkeit in DG- und CA1-Neuronen des Hippocampus. Wir zeigen, dass Hyperforin Hippocampus-Neuronen in TRPC6-abhängiger Weise erregt. Anschließend identifizierten wir ein für Hyperforin essentielles Bindungsmotiv im TRPC6-C-Terminus. Um die nachteiligen chemischen Eigenschaften von Hyperforin als antidepressiver Leitverbindung zu überwinden, haben wir das Phloroglucinol-Derivat Hyp13 synthetisiert. Wir zeigen, dass das Hyperforin-Analogon Hyp13 über das Hyperforin-Bindungsmotiv auf TRPC6 wirkt. Schließlich liefern wir Beweise dafür, dass Hyp13 abhängig von TRPC6-Kanälen antidepressive Wirkungen hat.

TRPC6-KO-Mäuse zeigten verstärkte angstähnliche Reaktionen im Freiland- und erhöhten Plus-Labyrinth-Test und zeigten verstärktes depressives Verhalten im Zwangsschwimmtest und im Saccharose-Präferenztest, was die Fähigkeit des Tieres widerspiegelt, hedonisches Vergnügen zu erleben. Bisher wurde das mit Depressionen verbundene Verhalten bei TRPC6-KO-Mäusen nicht untersucht. Allerdings führt chronischer unvorhersehbarer Stress in Kombination mit Isolation bei Ratten zu einer verringerten TRPC6-Expression im Hippocampus [42]. Eine verringerte synaptische Plastizität spiegelte sich in einer beeinträchtigten LTP, einer Verringerung der dendritischen Länge und der Dichte der Stacheln sowie in einer verringerten Färbung der postsynaptischen Dichte 95 (PSD-95) wider, einem Ersatz für die Dichte der Postsynapsen. Kürzlich veröffentlichte Daten deuten darauf hin, dass der virale Abbau von TRPC6 im DG von Mäusen einen nachteiligen Effekt auf kognitive Prozesse und angstähnliches Verhalten hat [43]. Ähnlich wie bei unseren Ergebnissen verbrachten mit shRNA-TRPC6 behandelte Tiere weniger Zeit im zentralen Bereich des Freilandtests als die Kontrollgruppe, was auf ein angstähnliches Verhalten hinweist. Auch die Mäuse der shRNA-TRPC6-Gruppe konnten im Dreikammertest nicht zwischen neuen und bekannten Mäusen unterscheiden und zeigten eine Beeinträchtigung des räumlichen Lernens und des Arbeitsgedächtnisses. Andere haben die Auswirkungen von TRPC6 auf Lernen und Gedächtnis beschrieben. Unter Verwendung des Square Open Field- und des Elevated Star Maze-Tests wurde eine verringerte Erkundungsaktivität bei TRPC6-KO-Mäusen festgestellt [44, 45]. Im Morris Water Maze zeigten transgene Mäuse, die TRPC6 überexprimierten, eine Verbesserung des räumlichen Lernens und des Gedächtnisses [26]. Wenn man bedenkt, dass eine veränderte Wahrnehmung eines der Symptome einer schweren Depression ist und eine schwere Depression einer der Hauptrisikofaktoren für Demenz ist, könnte TRPC6 ein Zusammenhang zwischen diesen psychiatrischen Erkrankungen sein. Mehrere Studien zeigten, dass der selektive TRPC6-Aktivator Hyperforin die Aβ-Spiegel senkt und die Verhaltensleistung in Tiermodellen zur Alzheimer-Krankheit (AD) und in In-vitro-Studien verbessert [46]. Darüber hinaus wurde bei Patienten mit AD und leichter kognitiver Beeinträchtigung eine Verringerung der TRPC6-Expression festgestellt, die negativ mit der kognitiven Leistung korrelierte [10].

Das beobachtete ängstliche und depressive Verhalten von TRPC6-KO-Mäusen ging mit einer verringerten neuronalen Erregbarkeit in DG-Körnerzellen und CA1-Pyramidenneuronen einher. Diese veränderte Erregbarkeit fällt mit der Expression des TRPC6-Kanals zusammen, der hauptsächlich in DG-Neuronen, Pyramidenneuronen und Interneuronen des Hippocampus exprimiert wird. Der Hippocampus ist eine hochgradig stressempfindliche Gehirnregion und seine Funktionsstörung kann zu den Konzentrationsdefiziten beitragen, die zu den diagnostischen Merkmalen einer schweren Depression gehören [47]. Die Reaktion auf Neuheiten wird durch Hippocampus-Afferenzen reguliert, die zum Nucleus accumbens und zum ventralen Tegmentalbereich projizieren [48]. Es wird auch diskutiert, dass eine eingeschränkte Funktion des Hippocampus an der Anhedonie beteiligt ist [49]. DG-Zellen und CA1-Pyramidenzellen von TRPC6-KO-Mäusen zeigen eine deutlich verringerte Zellerregbarkeit. Ähnliche Daten wurden von Griesi-Oliveira et al. erhalten. Herunterregulieren von TRPC6 in primären Mausneuronen mithilfe von shRNA [45]. Da TRPC6-Kanäle jedoch hauptsächlich in Interneuronen in CA1 exprimiert werden (23), könnte die verringerte Erregbarkeit in CA1-Neuronen in TRPC6-KO-Mäusen auch durch einen homöostatischen Mechanismus aufgrund des chronischen Mangels an TRPC6 in CA1-Interneuronen induziert werden. Ganzzellaufzeichnungen von APs zeigten im Vergleich zu Kontrollen eine signifikante Verringerung der Feuerrate von Neuronen, die shRNAs gegen TRPC6 exprimieren. Bemerkenswerterweise wurde auch in iPSC-abgeleiteten DG-ähnlichen Neuronen von Patienten mit bipolarer Störung ein aberrantes AP-Feuern als Reaktion auf Membrandepolarisation beobachtet [50]. Airan et al. lieferten Hinweise darauf, dass DG-Neuronen dynamische Veränderungen in Depressionsmodellen und nach chronischer SSRI-Behandlung zeigen [51]. Mithilfe der spannungsempfindlichen Farbstoffbildgebung wurde die DG-Aktivität in einem Modell mit chronischem, mildem Stress reduziert und kehrte sich nach chronischer Fluoxetin-Behandlung um. Diese verringerte Aktivität wird wahrscheinlich durch Atrophie in den Dendriten von DG vermittelt. Mehrere Gruppen zeigten eine Rolle von TRPC6 für die Morphologie und Verzweigung dendritischer Dornen. Die Verwendung von adeno-assoziierten viralen Vektoren (AAV), die kurze Haarnadel-RNA (shRNA) exprimieren und auf TRPC6 im Hippocampus-DG männlicher Mäuse abzielen, reduzierte die TRPC6-Proteinexpression und verminderte dendritische Stacheln von DG-Körnerneuronen [43]. Diese Daten legen nahe, dass das ängstliche und depressive Verhalten bei TRPC6-KO-Mäusen durch eine verringerte Erregbarkeit in DG-Neuronen verursacht werden könnte, die mit einer verringerten Anzahl von Stacheln und Dendriten einhergeht. Im Gegensatz dazu verbessert Hyperforin die synaptische Plastizität im Hippocampus und im präfrontalen Kortex, indem es die Wirbelsäulenmorphologie [24] und die Expression von CREB- [52, 53], BDNF- [54] und TrKB-Rezeptoren [42, 55] verändert.

Während frühere Studien, die den FST umfassten, Hilflosigkeitsparadigmen, Vermeidungsdefizitmodelle und das EPM erlernten, eine antidepressive und anxiolytische Wirkung von Hyperforin zeigten [42, 54, 56, 57, 58], stellte ein aktueller Bericht die Frage, ob Hyperforin ein spezifischer TRPC6-Aktivator ist [ 7, 8]. In dieser Studie erhöhte Hyperforin die Erregbarkeit in den DG-Neuronen bei WT-Mäusen. Dieser Effekt wurde bei TRPC6-KO-Mäusen aufgehoben, ebenso wie der Hyperforin-induzierte Einwärtsstrom. Da der durch Hyperforin induzierte, verzögerte, durch Kalium vermittelte Strom in TRPC6-KO-Mäusen bestehen bleibt, könnte dies ein unabhängiger Wirkmechanismus sein. Um die Wechselwirkung von Hyperforin mit TRPC6 weiter zu untersuchen, führten wir ortsgerichtete Mutageneseexperimente durch, die sich auf Aminosäuren konzentrierten, die sich zwischen TRPC6 und den eng verwandten TRPC3- und TRPC7-Kanälen unterscheiden, die durch Hyperforin nicht aktiviert werden können. So konnten wir ein Bindungsmotiv im C-Terminus von TRPC6, 777LLKL780, identifizieren, das die Hyperforinsensitivität vermittelt. Diese vier Reste, die nicht innerhalb der TRPC-Familie konserviert sind, befinden sich zwischen dem TRP-Reentry und der C-terminalen Helix 1, einer Region mit ungeordneten Aminosäuren (766–854) in Kryo-EM-Strukturen [19, 22]. Diese Region enthält auch die mutmaßlichen Inositolhexaphosphat- (842–868) und die Calmodulin/IP3-Rezeptor-Bindungsstellen (838–872) [59]. Der Anstieg des TRPC6-vermittelten Ca2+-Einstroms durch SAG und OAG, beides Analoga des nativen Lipidagonisten DAG, wurde in den mutierten Kanälen nicht verändert. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass weder die Proteinfaltung, der Transport noch die Oberflächenexpression von TRPC6 durch das Hyperforin-Bindungsmotiv 777LLKL780 beeinflusst werden.

Darüber hinaus zeigen wir, dass diese Region nach der Isolierung α-helikal ist, mit Liposomen interagiert und die Membranflüssigkeit beeinflusst. Die Tryptophan-Fluoreszenzspektroskopie, die sich einen nativen Rest in der Nähe der vorgeschlagenen Hyperforin-Bindungsstelle zunutze macht, zeigt, dass tatsächlich eine direkte Wechselwirkung zwischen der C-terminalen Region von TRPC6 und Hyperforin besteht. Diese Interaktion wird reduziert, wenn das 777LLKL780-Motiv mutiert ist. Interessanterweise werden die Membraninteraktion und die daraus resultierenden Fluiditätsänderungen auch durch die Anwesenheit von Hyperforin verstärkt.

Da Hyperforin mehrere Mängel aufweist, wie z. B. eine schlechte chemische Stabilität oder die Induktion von Arzneimittelwechselwirkungen als Leitverbindung für weitere Entwicklungen [29], haben wir ein chemisch vereinfachtes und stabiles Hyperforin-Analogon synthetisiert und untersucht, das den Phloroglucinol-Kern teilt, Hyp13. Hyp13 basiert auf den zuvor veröffentlichten Hyp-Derivaten unserer Gruppe und teilt alle Funktionen mit Hyperforin. Wir haben gezeigt, dass Hyp13 TRPC6 in ähnlicher Stärke aktiviert, keine Wirkung auf TRPC3 zeigt und an das identifizierte Bindungsmotiv LLKL bindet. Darüber hinaus aktiviert Hyp13 im Gegensatz zu Hyperforin weder PXR noch induziert es CYP3A4. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Hyp13 im Vergleich zu Hyperforin, das bekanntermaßen zu schwerwiegenden Wechselwirkungen zwischen Arzneimitteln führt, ein günstigeres Wechselwirkungsprofil aufweist. Allerdings zeigten Hyperforin und Hyp13 bei Konzentrationen über 5 µM nach 24 Stunden in HepG2- und HepaRG-Zellen ähnliche zytotoxische Wirkungen. Diese Konzentrationen liegen weit über den Konzentrationen, die in Verhaltensexperimenten an Mäusen erreicht wurden. Für Hyperforin wurden nach oraler Behandlung bei Mäusen nanomolare Gehirnkonzentrationen beobachtet, die mit den Konzentrationen übereinstimmten, die zur Veränderung der synaptischen Plastizität über die Aktivierung von TRPC6-Kanälen erforderlich waren [24, 60]. Wichtig ist, dass Hyp13 im Freilandtest, im Neuheitsunterdrückungstest und im Zwangsschwimmtest antidepressive und anxiolytische Wirkungen zeigt. Es ist zu beachten, dass diese Effekte bereits nach einer akuten Behandlung beobachtet wurden, während Hyperforin beim Menschen mehrere Wochen benötigt, um seine volle antidepressive Wirkung zu entfalten. Dies könnte auf eine schnellere Wirkung von Hyp13 im Vergleich zu Hyperforin hinweisen. Allerdings zeigen die angewandten Tests eine prädiktive Validität, da sie die Arzneimittelwirkung anzeigen, jedoch nicht auf der menschlichen Zeitskala, wie dies für andere Antidepressiva der Fall ist [61]. Die emotionalen Wirkungen von Hyp13 waren bei TRPC6-KO-Mäusen reduziert.

Zusammenfassend zeigen wir die Rolle von TRPC6-Kanälen bei Depressionen und Angstzuständen und liefern Beweise dafür, dass TRPC6-Kanäle neue medikamentöse Ziele für Therapien bei Stimmungsstörungen sind. Diese Ergebnisse könnten auch den Weg für neue Moleküle zur Behandlung anderer psychiatrischer Erkrankungen ebnen, die mit einer TRPC6-Dysfunktion verbunden sind, wie Autismus oder Alzheimer.

Hyperforin wurde freundlicherweise von Dr. Willmar Schwabe (Karlsruhe, Deutschland) zur Verfügung gestellt. Hyperforin und Hyp13 wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO; Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland #A994.1) verdünnt und bis zur Verwendung bei –20 °C gelagert. 1-Oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol (OAG; Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland; #O6754) wurde in DMSO gelöst und bei 100 mM Stammlösung 1-Stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol-d8 gelagert (SAG; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA; #sc-220503) wurde in DMSO gelöst und in einer 50 mM Stammlösung bei –20 °C gelagert. Rifampicin (CAS 13292-46-1) und SR12813 (CAS 126411-39-0) wurden von Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Deutschland) bezogen. Standard-Laborchemikalien wurden von Sigma-Aldrich oder Carl Roth bezogen.

Hyp13 wurde nach Bharate et al. synthetisiert. [62]. wurde in einer zweistufigen Sequenz ausgehend von Phloroglucinol realisiert, das zunächst unter Friedel-Crafts-Bedingungen mit Isovalerylchlorid behandelt wurde, um Hyp1 zu ergeben. Anschließend wurde Hyp13 durch Alkylierung von Hyp1 mit 1-Iodbutan in Gegenwart von Natriummethoxid als Base und chromatographische Trennung der gebildeten Isomere erhalten.

Der pcDNA3.1-Plasmidvektor mit DNA, die für menschliches TRPC6 (Uniprot-ID: Q9Y210) und menschliches TRPC3 (Uniprot-ID: Q13507) kodiert, beide C-terminal an eYFPs fusioniert, wurde als Vorlagen für hTRPC6 777IMRI780-eYFP und hTRPC3 708LLKL711-eYFP verwendet Mutanten. Für die ortsspezifische Mutagenese verwendeten wir Primersequenzen (speziell angefertigt von Sigma Aldrich, Deutschland), die für die geplanten Mutationen kodierten. Die Primersequenzen waren wie folgt:

5'TCTGGTGCCGAGTCCAAAGTCCCTGTTTTATCTCATAATGCGCATTAAAAAATGGATTTCTGAGCTGTTCCAGGGCC

5′GCTCAGAAATCCATTTTTTAATGCGCATTATGAGATAAAACAGGGACTTTGGACTCGGCACCAGATTGAAGGGTACAGG;

5′-GTTTATTTCCTCCTGAAACTTGTTAACTTTCCCAAATGCAGAAGGAGAAG;

5′-TGGGAAAGTTAACAAGTTTCAGGAGGAAAATAACAAATGATTTTGGACTAGG.

PCRs wurden unter folgenden Bedingungen durchgeführt: anfängliche Denaturierung für 3 Minuten bei 95 °C und 25 Denaturierungszyklen für 20 Sekunden bei 98 °C, Annealing zwischen 75–80 °C für 15 Sekunden und Verlängerung bei 72 °C für 5 Minuten . Die Amplifikation wurde unter Verwendung von High-Fidelity-DNA-Polymerase (Roche, Mannheim, Deutschland; #KK2101) durchgeführt. Die Matrizen-DNA wurde durch Verdauung mit DpnI (New England Biolabs, Frankfurt am Main, Deutschland; # R0176S) entfernt und amplifizierte DNA wurde für die Transformation kompetenter DH5α-Escherichia coli-Zellen (ThermoFisherScientific, Darmstadt, Deutschland; # 18265017) verwendet. Plasmid-DNAs mehrerer Klone wurden aus vorgegossenen Agarplatten mit 100 μg/ml Ampicillin isoliert und durch Sanger-Sequenzierung bestätigt. Zur Transfektion wurden groß angelegte DNA-Präparationen mit dem Plasmid Maxiprep Kit (Zymo Research Europe GmbH, Freiburg im Breisgau, Deutschland; #D4202) durchgeführt.

Menschliche embryonale Nierenzellen (HEK 293) wurden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; ThermoFisherScientific, Darmstadt, Deutschland; Nr. 41965039) kultiviert, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FCS; ThermoFisherScientific, Darmstadt, Deutschland; Nr. 10500-064). ) und 10 mM Penicillin/Streptomycin (Pen-Strep; ThermoFisherScientific, Darmstadt, Deutschland; #15140122) bei 37 °C. Zur Transfektion wurden HEK 293-Zellen auf mit Poly-L-Lysin (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland; Nr. P2636) beschichteten Glasdeckgläsern in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 0,1 × 106 Zellen pro Well für die Einzelzell-Calcium-Bildgebung gezüchtet und Western Blot und mit einer Dichte von 0,5 × 105 Zellen für elektrophysiologische Messungen. Nach 24 Stunden wurden die Medien ausgetauscht und die Zellen wurden vorübergehend mit einem Transfektionscocktail transfiziert, der 0,5–1 μg DNA, 2 μl Effectene (Qiagen, Hilden, Deutschland; #301425) Transfektionsreagenz und 50 μl Opti-MEM (ThermoFisherScientific, Darmstadt, Deutschland; #51985034) mittel. Die Einzelzell-Calcium-Bildgebung, der Western Blot und die elektrophysiologische Untersuchung wurden 24 Stunden nach der Transfektion durchgeführt. Alle Zelllinien wurden mittels PCR-Test negativ auf Mykoplasmenkontamination getestet.

Transfizierte und nicht transfizierte HEK 293-Zellen wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; pH 7,3) gewaschen, pelletiert und in RIPA-Puffer (Radioimmunpräzipitationsassay) (50 mM Tris-HCl, 1 % Triton X-100, 150 mM NaCl, 0,5) lysiert % Na-Desoxycholat, 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), enthaltend den cCOMPLETETM-Proteaseinhibitor-Cocktail (Roche, Mannheim, Deutschland; #04693159001). Die Proben wurden 30 Minuten lang lysiert bei 4 °C und 10 Minuten lang bei 4 °C mit 14.000 U/min zentrifugiert. Die Überstände wurden zu 4 × SDS-Laemmli-Puffer (Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland #K929.1) gegeben und gekocht, und die Proteine ​​wurden um 8 % getrennt. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE). Die Gele wurden über 2 h bei 4 °C bei 80 mV auf PVDF-Membranen geblottet. PVDF-Membranen wurden über 3 h mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA; Carl Roth, Karlsruhe) blockiert , Deutschland; #T844.3) in TBS-Puffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl) mit 0,1 % Tween 20, inkubiert mit für TRPC6 spezifischen Antikörpern (Alomone Labs, Jerusalem, Israel; #ACC-017) 1:400-fach verdünnt, TRPC3 (Cell Signaling, Frankfurt am Main, Deutschland; #D4P5S) 1:1000-fach verdünnt und ß-Actin (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Deutschland; #A1978) 1 verdünnt: 2000. TRPC6- und TRPC3-Antikörper wurden in TBS/0,1 % Tween 20-Puffer mit 5 % BSA verdünnt und b-Actin-Antikörper wurden in TBS/0,1 % Tween 20-Puffer mit 1 % BSA verdünnt. Die Membranen wurden dreimal in TBS/0,5 % Tween 20-Puffer gewaschen, 60 Minuten lang mit Meerrettichperoxidase-gekoppelten Antikörpern gegen die Primärantikörper inkubiert, erneut dreimal in TBS/0,5 % Tween 20-Puffer gewaschen und mit dem elektrogenerierten Chemilumineszenzreagenz entwickelt ( ECL; GE Healthcare Europe, München, Deutschland; #RPN2236). Die Western-Blot-Visualisierung wurde mit dem iBright CL1500 Imaging System (ThermoFisherScientific, Darmstadt, Deutschland) durchgeführt.

Ganzzellige Patch-Clamp-Aufzeichnungen wurden in HEK 293-Zellen durchgeführt. Patchpipetten wurden aus Borosilikatglaskapillaren (Science Products, Hofheim, Deutschland; GB150F-10P) mit einem P-1000-Mikropipettenzieher (Sutter Instruments, Novato, USA) hergestellt. Der Pipettenwiderstand variierte zwischen 4 und 8 MΩ. Ganzzellströme wurden durch Spannungsrampen von –100 bis +100 mV (400 ms Dauer) hervorgerufen, die alle 10 s ab einem Haltepotential von 0 mV angelegt wurden. Ströme durch die Pipette wurden mit dem EPC 10 USB-Verstärker und der Patchmaster-Software (Patchmaster, HEKA Electronics, RRID:SCR_000034, Deutschland) aufgezeichnet, bei 2,9 kHz gefiltert (Bessel-Filter), bei 4 kHz digitalisiert und mit der Fitmaster-Software (Fitmaster, HEKA) analysiert Electronics, Lambrecht, Deutschland; RRID:SCR_016233) und Igor Pro 8.0 (Wavemetrics, Tigard, USA). Pro Deckglas wurde eine Zelle erfasst, für jedes Experiment wurden mindestens drei unabhängige Zellpräparate untersucht. Pipetten wurden mit einer intrazellulären Lösung gefüllt, die 130 mM CsCH3O3S, 10 mM CsCl, 2 mM MgCl2 und 10 mM HEPES (pH 7,2 mit CsOH) enthielt. Die extrazelluläre Standardlösung enthielt 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM Glucose und 10 mM HEPES (pH 7,4 mit NaOH).

[Ca2+]i-Messungen in HEK293-Zellen wurden unter Verwendung des Fluoreszenzindikators Fura-2-acytoxymethylester (Fura 2-AM; ThermoFisherScientific, Darmstadt, Deutschland; #F1201) in Kombination mit einem monochromatorbasierten Bildgebungssystem (TILL Photonics; FEI, Gräfeling, Deutschland), befestigt an einem Fluidimmersionsobjektiv (LUMPLFLN 40XW/0,80 W). Die Zellen wurden mit einem Cocktail bestehend aus 2,5 μM Fura 2-AM, 0,01 % Pluronic-F127 (ThermoFisherScientific, Darmstadt, Deutschland; #P6866) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (22–24 °C) in einer Standard-Hank's Balanced Salt Solution beladen (HBSS)-Puffer bestehend aus 138 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 und 10 mM HEPES ([4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure]), eingestellt mit NaOH bei Raumtemperatur auf pH 7,4 . Anschließend wurden die Zellen mit HBSS gewaschen und weitere 30 Minuten bei RT in HBSS belassen. Anschließend wurden Deckgläser in einer Badekammer aus Plexiglas auf dem Tisch des Mikroskops (Olympus BX51WI, Hamburg, Deutschland) montiert. Der Ca2+-Einstrom wurde in der TillVision Live-Erfassungs- und Offline-Analysesoftware [ehemals FEI Munich GmbH (Till Photonics), jetzt Thermo Fisher Scientific] als Verhältnis von 340/380 nm mit einem 40-fachen Objektiv aufgezeichnet und visualisiert. Ca2+-gebundenes Fura2-AM ist bei 340 nm anregbar, der ungebundene Zustand von Fura2-AM bei 380 nm. Das Verhältnis wurde durch Analysen der Emission berechnet, die nach Anregung mit jeder Wellenlänge bei 510 nm nachweisbar war.

hTRPC6- und hTRPC6mut-Peptide wurden von Peptides & Elephants (Henningsdorf, Deutschland) synthetisiert. Insbesondere wurden ein Peptid mit den Resten 766–811 des menschlichen TRPC6-C-Terminus (766LVPSKSLFYLLKLKKWISELFQGHKKGFQEDAEMNKINEEKKL811) und das Peptid mit dem mutierten Motiv IMRI, wie in TRPC3 identifiziert (766LVPSKSLFYIMRIKKWISELFQGHKKGFQEDAEMNKINEEKKL811), erhalten. Um Verunreinigungen zu entfernen, wurden die Peptide in 50 mM Tris pH8 und 150 mM NaCl gelöst und mehrere Tage lang gegen denselben Puffer dialysiert. Um Salze zu entfernen, wurden die Peptide weitere 7 Tage lang gegen Milli-Q-Wasser dialysiert und die endgültige Peptidkonzentration auf 100 µM eingestellt oder lyophilisiert und bis zur weiteren Verwendung bei –20 °C gelagert.

CD-Spektren wurden mit dem CD-Spektrometer Jasco-815 bei 25 °C und in einem Wellenlängenbereich von 190–260 nm aufgenommen. TRPC6- und TRPC6mut-Peptide wurden in 10 mM Tris, pH 8, 30 mM NaCl mit einer Peptidkonzentration von 20 µM gelöst.

POPC- und POPG-Lipide in Chloroform wurden in einem Molverhältnis von 70:30 gemischt. Die Lipidmischung mit einem Zusatz von 1-[6-(Dimethylamino)-2-naphthalinyl]-1-dodecanon (Laurdan) (Molverhältnis Laurdan:Lipid 1:500) wurde unter Stickstoffstrom und Vakuum getrocknet, um einen Lipidfilm zu erhalten. Der Lipidfilm wurde in 20 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl resuspendiert, um eine Gesamtlipidkonzentration von 500 µM zu erreichen. Kleine unilamellare Vesikel (SUV) wurden mit fünf Einfrier-Auftau-Zyklen und anschließender Extrusion durch eine 50-nm-Membran hergestellt.

50 µM der Lipid/Laurdan-Mischung (siehe oben) wurden mit 5 µM TRPC6-Peptiden vorinkubiert. Hyperforin mit unterschiedlicher Konzentration wurde der Mischung frisch zugesetzt und die Spektren wurden mit einem Fluoromax-4-Fluorimeter (Horiba Scientific) aufgezeichnet. Emissionsspektren wurden von 400–550 nm mit einer Anregungswellenlänge von 340 nm und einer Spaltbreite von 1 nm bei 25 °C aufgenommen. Fluoreszenzintensitäten bei 440 nm und 490 nm wurden verwendet, um den erzeugten Polarisationswert GP zu berechnen und auf diesen ΔGP-Werten zu basieren.

Alle Experimente wurden auf einem Fluoromax-4 (Horiba Scientific) Fluorimeter mit einer Peptidkonzentration von 5 µM in 20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl und den folgenden Parametern durchgeführt: Anregungswellenlänge: 280 nm, Emissionswellenlänge 300–450 nm , Spaltbreite 2 nm, 25 °C.

Es wurden männliche B6J;129S8-Wildtyp-Mäuse (WT) und B6J;129S8-Trpc6tm1Lb1-Mäuse (MMRRC stock NO 37345-Jax; TRPC6 KO) untersucht. Die Tiere wurden in Gruppen in Standard-Makrolonkäfigen (Typ III) gehalten. Sie wurden mit Futter und Wasser nach Belieben versorgt, mit Papiertüchern als Käfigbereich ausgestattet und in einem 12:12-Stunden-Licht-Dunkel-Zyklus gehalten (Licht an um 07:00 Uhr). Alle Mäuse wurden im Alter von 3–4 Monaten getestet. Verhaltenstests wurden während des Lichtzyklus zwischen 09:00 und 16:00 Uhr durchgeführt. Die Raumtemperatur wurde zwischen 19 und 22 °C bei einer Luftfeuchtigkeit von 55 % (±10 %) gehalten. Alle Verhaltenstests wurden von Experimentatoren durchgeführt, die keine Ahnung von Hypothesen und/oder Genotypen hatten. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health für die humane Behandlung von Tieren und der Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaften (86/609/EWG) durchgeführt und von der örtlichen Regierungskommission für Tiergesundheit (deutsche Landesverwaltung Bayern/Regierung) genehmigt von Mittelfranken).

Mäuse wurden in einer Reihe von Verhaltenstests in der folgenden Reihenfolge getestet: offenes Feld, erhöhtes Plus-Labyrinth, Hell-Dunkel-Box, Neuheitsunterdrückungsfütterung, erzwungener Schwimmtest und Saccharose-Präferenztests. Alle Tests wurden an verschiedenen Tagen durchgeführt, mit einem Abstand von 3 Tagen zwischen den einzelnen Tests. Die Mäuse wurden in pseudozufälliger Reihenfolge getestet und unmittelbar vor dem Test in den Verhaltensbereich neben dem Wohnraum gebracht. Jedes Testgerät wurde zwischen den Probanden mit 50 % Ethanol gereinigt, um jegliche olfaktorische Hinweise zu vermeiden, die das Verhalten beeinflussen. Am Ende jedes Tests wurden die Mäuse in ihre Heimkäfige zurückgebracht und konnten sich erholen. Es wurden nur Tiere analysiert, die während der gesamten Testzeit einen guten Gesundheitszustand zeigten und von denen ein vollständiger Datensatz für das jeweilige Paradigma gemessen werden konnte. Das Verhalten aller Tests wurde auf Video aufgezeichnet und anschließend von einem Beobachter bewertet, der für Hypothesen und Behandlung blind war. Die Verhaltensexperimente wurden von Experimentatoren durchgeführt, die zum Zeitpunkt der Tests lediglich Tierzahlen und Testprotokolle erhielten. In den Testprotokollen wurden die Reihenfolge der Tests und die Zuweisung der Testboxen vom PI pseudozufällig ausgeglichen. Die Behandlungszuteilung (Randomisierung) für Mäuse in allen Tierversuchen erfolgte durch Entnahme der Tierzahlen aus einem Behälter. Die Behandlungszuordnung zu den Mutanten- und WT-Mäusen erfolgte zufällig durch Auslosung der Tierzahlen.

Jede Maus wurde 20 Minuten lang in eine quadratische weiße Acrylarena (50 × 50 cm) mit Blick auf eine Außenwand gesetzt (die Parameter wurden in 5-Minuten-Blöcken gemessen und zusammengefasst) und konnte die Arena frei erkunden. Während des Tests wurde weißes Licht von 25 Lux gleichmäßig über die Arena verteilt. Videoaufzeichnungen wurden mit Biobserve Viewer III (Biobserve, Bonn, Deutschland) aufgenommen und analysiert. Als „zentrale Zone“ wurde ein virtuelles Quadrat mit gleichem Abstand von der Peripherie (36 × 36 cm) definiert, um die Anzahl der Eintritte und die in der zentralen Zone verbrachte Zeit zu bestimmen. Die in der äußeren und mittleren Zone zurückgelegte Distanz (cm), die Anzahl der Eintritte und die in der zentralen Zone verbrachte Zeit wurden registriert [63,64,65].

Die erhöhte Plus-Stute wurde aus schwarzem, undurchsichtigem Acryl mit weißem Futter auf dem Boden hergestellt, wobei jeder Arm 30 × 5 cm und die zentrale Plattform 5 × 5 cm maß. Ein Satz einander gegenüberliegender Arme war vollständig von einer 15 cm hohen Wand aus undurchsichtigem Acryl umgeben, während der andere Satz offen war und auf beiden Seiten der Arme einen Vorsprung von 0,5 cm aufwies. Das Labyrinth wurde auf einem transparenten Acrylständer 50 cm über dem Boden erhöht. Jede Maus wurde mit dem Gesicht zu einem geschlossenen Arm auf die zentrale Plattform gestellt und durfte das Labyrinth 5 Minuten lang frei erkunden. Die Tracking-Software Biobserve Viewer III (Biobserve) wurde verwendet, um die Bewegungsaktivität während des Tests (in den offenen und geschlossenen Armen zurückgelegte Strecke) sowie die Anzahl der Eintritte in die geschlossenen und offenen Arme und die darin verbrachte Zeit aufzuzeichnen. Ein Armeintritt wurde gezählt, wenn zwei Pfoten in einen Arm eingedrungen waren, und ein Armaustritt wurde festgestellt, wenn zwei Pfoten den Arm verlassen hatten [63,64,65].

Für den Zwangsschwimmtest wurde jede Maus 15 Minuten lang in einen transparenten Glaszylinder (17 cm Durchmesser, 18 cm Höhe) gelegt, der mit Wasser (12 cm, 25 °C) gefüllt war. Dann wurde ein Tier in den Heimkäfig zurückgebracht. Nach 24 Stunden wurden die Mäuse erneut für 5 Minuten in diesen Zylinder mit Wasser gegeben. Die Latenz des ersten Floatings und die gesamte Floating-Zeit wurden manuell aufgezeichnet [63,64,65].

Die Tiere wurden einzeln gehalten und hatten sieben Tage vor dem Saccharose-Präferenztest Zugang zu zwei Flaschen Wasser. Am 8. Tag wurde das Wasser in einer Flasche durch 2 %ige Saccharoselösung ersetzt und die Position der Flaschen mit Wasser und Saccharoselösung wurde während der nächsten 5 Tage täglich geändert. Das Gewicht der Tiere wurde vor und nach dem Test gemessen und das Volumen an Wasser und Saccharoselösung täglich geschätzt. Die Saccharosepräferenz in % der getrunkenen Flüssigkeit während der Baseline- und Testphase wurde berechnet [26,27,28].

Hyp13 wurde in Kochsalzlösung gelöst. Die Tiere erhielten 20 Minuten vor jedem Verhaltenstest eine ip-Injektion (vinj = 10 ml/kg) mit entweder 0, 1 oder 5 mg/kg.

Horizontale Hippocampusschnitte (350 µm) wurden aus mit Sevofluran betäubten männlichen WT- und TRPC6-KO-Mäusen (2–4 Monate alt) in eiskalter künstlicher Liquorflüssigkeit (aCSF) hergestellt, die eine hohe Saccharosekonzentration (in mM) enthielt: 75 Saccharose , 87 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2, 7 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 25 NaHCO3 und 10 D-Glucose. Die Schnitte wurden dann in warmes aCSF (35 °C; 10 Min.) überführt und anschließend bei Raumtemperatur in aCSF mit 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM CaCl2, 3 mM MgCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3 und 10 mM aufbewahrt D-Glukose. Einzelne Scheiben wurden in eine getauchte Aufnahmekammer (perfundiert mit normalem aCSF mit 2,5 mM CaCl2 und 1,5 mM MgCl2 bei 31 ± 1 °C) überführt, die auf dem Tisch eines aufrechten Mikroskops montiert war. Alle Lösungen wurden mit 95 % O2/5 % CO2 begast, um den pH-Wert bei etwa 7,4 zu halten. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem deutschen Tierschutzgesetz und der Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaften vom November 1986/86/609/EWG sowie mit Genehmigung der örtlichen Regierung durchgeführt.

Hippocampale CA1-Pyramidenzellen und Granulatzellen des Gyrus dentatus (DG) (in der suprapyramidalen Klinge) wurden mittels Dodt-Gradientenkontrast sichtbar gemacht und mit Patchpipetten aufgezeichnet, die mit (in mM) 135 K-Gluconat, 4 NaCl, 10 KCl, 5 Hepes gefüllt waren , 2 Na2-ATP und 0,3 Na3-GTP (pH 7,3), sofern nicht anders angegeben. Alle Potentiale wurden um das Liquid-Junction-Potenzial korrigiert. Die passiven Membraneigenschaften von Hippocampus-Neuronen (z. B. Kapazität, Eingangswiderstand) wurden durch einen Membrantest kurz nach dem Übergang in den Ganzzellmodus mit einer Membranspannung von –70 mV registriert. Um die neuronale Erregbarkeit im Current-Clamp-Modus zu testen, wurde ein depolarisierendes Rampenprotokoll mit Strominjektion von 0 bis 100 pA innerhalb von 2 s verwendet, um Aktionspotentiale (APs) beim Ruhemembranpotential (RMP) und bei –70 mV auszulösen. Um den ionischen Mechanismus der durch Hyperforin hervorgerufenen Reaktion zu untersuchen, wurden Körnerzellen im Spannungsklemmenmodus (Vh von –70 mV) aufgezeichnet und eine Spannungsrampe im Bereich von –50 bis –140 mV (in 1 s) wurde verwendet, um die Umkehrung zu bestimmen Potenzial. In einigen Experimenten wurde K-Gluconat in der Pipettenlösung durch Cs-Gluconat (CsGlu) ersetzt.

Die Daten wurden mit einem Multiclamp 700B-Verstärker in Verbindung mit der Digidata 1440A-Schnittstelle und der pClamp10.2-Software (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) gesammelt. Die Signale wurden mit 20 kHz digitalisiert und mit 6 kHz (Stromklemme) oder 2 kHz (Spannungsklemme) gefiltert. MiniDigi 1A und AxoScope 10.2 wurden für die Oszilloskopaufzeichnung mit niedriger Auflösung und einer Abtastrate von 1 kHz verwendet. Die Datenanalyse wurde offline mit der Software Clampfit 10.2 (Molecular Devices) durchgeführt. Für Statistiken und Zahlen wurde OriginPro 2018G (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA) verwendet.

HepaRG-Zellen (Biopredic International, Sant Grégoire, Frankreich) wurden in William's E-Medium mit 2 mM Glutamin (PAN-Biotech, Aidenbach, Deutschland), ergänzt mit 10 % FBS (FBS Good Forte EU-zugelassen; PAN-Biotech, Aidenbach, Deutschland), kultiviert. , 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin (Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Deutschland), 0,05 % Humaninsulin (PAN-Biotech, Aidenbach, Deutschland) und 50 µM Hydrocortison-Hemisuccinat (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) [ 41]. Die Zellen wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers ausgesät (Platten mit 96 Vertiefungen: 9.000 Zellen/Vertiefung, Platten mit 12 Vertiefungen: 100.000 Zellen/Vertiefung). Während der Proliferation wurden die Zellen zwei Wochen lang im Kulturmedium gehalten. Anschließend wurden die Zellen noch zwei Wochen lang zur Differenzierung im oben beschriebenen Kulturmedium, das zusätzlich 1,7 % DMSO enthielt, kultiviert. 48 Stunden vor der Inkubation wurden HepaRG-Zellen an Behandlungsmedium angepasst, das niedrigere Konzentrationen an DMSO (0,5 %) und FBS (2 %) enthielt. Damit die Zellen ihre CYP-Expression senken können, muss die DMSO-Konzentration reduziert werden. Andernfalls ist keine zusätzliche CYP-Induktion sichtbar.

Anschließend wurde eine Behandlung mit den jeweiligen Testverbindungen und Kontrollen, verdünnt in Behandlungsmedium mit einer DMSO-Endkonzentration von 0,5 %, durchgeführt. HepaRG-Zellen wurden zur Genexpressionsanalyse verwendet. Aufgrund der schlechten Transfektionseffizienz von HepaRG-Zellen wurden Reportergentests in HepG2-Zellen durchgeführt.

HepG2-Zellen (ATCC, Middlesex, UK) wurden in DMEM High Glucose-Medium (Pan-Biotech, Aidenbach, Deutschland), ergänzt mit 10 % FBS (FBS Superior; Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) und 100 U/ml Penicillin und 100, kultiviert µg/ml Streptomycin (Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Deutschland). Für Experimente wurden die Zellen mit einer Konfluenz von etwa 80–90 % in 96-Well-Platten ausgesät.

Die zytotoxischen Wirkungen der Testverbindungen wurden mit dem Zellproliferationsreagens WST-1 (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) analysiert. HepG2-Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen (20.000 Zellen/Vertiefung) ausgesät und 24 Stunden nach der Aussaat mit den Testverbindungen behandelt. HepaRG wurde in 96-Well-Platten (9000 Zellen/Well) ausgesät und nach 28 Tagen Differenzierung und 48 Stunden vorheriger Inkubation wurden die Zellen wie oben beschrieben an das Behandlungsmedium angepasst und anschließend 24 Stunden lang mit Testverbindungen inkubiert.

Alle Testverbindungen und Kontrollen werden in Kulturmedium mit einer endgültigen Lösungsmittelkonzentration von 0,5 % DMSO gelöst. Als Positivkontrolle diente Triton X-100 (0,01 %). Eine Stunde vor Ende der Inkubation wurden 10 μl WTS-1-Reagenz in jede Vertiefung mit 100 μl Medium gegeben und die Platten wurden eine weitere Stunde inkubiert. Anschließend wurde die Absorption bei 450 nm mit einer Referenzwellenlänge von 620 nm mit dem Tecan-Plattenlesegerät Infinite M200 Pro (Tecan-Gruppe, Männedorf, Schweiz) gemessen. Werte der Referenzwellenlänge wurden von den Absorptionswerten subtrahiert, und die Daten wurden hinsichtlich der Hintergrundabsorption korrigiert, indem die Werte von Wells subtrahiert wurden, die ohne Zellen inkubiert wurden. Die Daten wurden auf die Lösungsmittelkontrolle bezogen, die auf 100 % eingestellt war. Es wurden mindestens drei unabhängige biologische Replikate mit drei technischen Replikaten pro Bedingung durchgeführt.

Es wurden Dual-Luciferase-Reporter-Assays durchgeführt, um die Aktivierung des humanen Pregnan-X-Rezeptors (PXR) über einen GAL4-basierten Transaktivierungsassay zu messen, bei dem die LBD von PXR mit der DBD von GAL4 (pGAL4-hPXR-LBD) gekoppelt wurde ein auf GAL4 reagierender UAS-gesteuerter Glühwürmchen-Luciferase-Reporter (pGAL4-(UAS)5-TK-LUC) [40]. Die agonistische Bindung einer Testverbindung an die LBD von PXR führt zur Aktivierung des Fusionsproteins, das an die UAS bindet und die Transkription des Firefly-Luciferase-Gens initiiert.

Zusätzlich wurden die Zellen immer mit einem Plasmid transfiziert, das konstitutiv das Reportergen Renilla-Luciferase (pcDNA3-Rluc) exprimierte, als interne Kontrolle für die Normalisierung. Plasmidkonzentrationen und Positivkontrollen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Um Dual-Luciferase-Reporter-Assays durchzuführen, wurden 20.000 HepG2-Zellen für den PXR-Assay in 96-Well-Platten ausgesät. Die Zellen wurden 24 Stunden nach der Aussaat mit TransIT-LT1 (Mirus Bio LCC, Madison, WI, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers vorübergehend transfiziert. Nach 4–6 Stunden wurden die Zellen mit Testverbindungen oder Kontrollen in Kulturmedium mit 0,5 % DMSO inkubiert. Als Positivkontrollen wurden die bekannten PXR-Agonisten SR12813 und Rifampicin verwendet. Nach 24-stündiger Inkubation wurden die Zellen mit 50 µL Lysepuffer (100 mM Kaliumphosphat mit 0,2 % (v/v) Triton X-100, pH 7,8) lysiert. Fünf µL Zelllysat wurden auf Glühwürmchen- und Renilla-Luciferase-Aktivitäten untersucht. Die Lumineszenz wurde mit einem Plattenlesegerät Infinite M200 Pro (Tecan-Gruppe, Männedorf, Schweiz) gemessen. Das Glühwürmchensignal wurde auf das Renilla-Signal normalisiert und relativ zur Lösungsmittelkontrolle (enthaltend 0,5 % DMSO) ausgedrückt. Es wurden drei unabhängige biologische Replikate mit sechs technischen Replikaten pro Bedingung durchgeführt.

HepaRG-Zellen wurden in Platten mit 12 Vertiefungen (100.000 Zellen/Vertiefungen) ausgesät und wie oben beschrieben kultiviert. Nach der Differenzierung der Zellen und anschließender 48-stündiger Kultivierung mit Behandlungsmedium wurden die Zellen 24 Stunden lang mit Testverbindungen und Rifampicin als Positivkontrolle inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen und mit 350 μl RLT-Puffer (RNeasy Mini Kit, Qiagen, Hilden Deutschland) geerntet, der 3,5 μl β-Mercaptoethanol enthielt. Die Gesamt-RNA wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers mit geringfügigen Änderungen extrahiert (66). Die Qualität und Quantität der RNA wurde mit einem Plattenlesegerät Tecan Infinite M200 Pro (Tecan-Gruppe, Männedorf, Schweiz) gemessen. Die reverse Transkription von 0,5 µg RNA wurde mit dem High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland) durchgeführt. Quantitative Echtzeit-RT-PCR wurde unter Verwendung von 20 ng cDNA, dem Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermofisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) und Primern (5 µM; siehe Tabelle 2) durchgeführt. Das Primerdesign wurde mit dem kostenlos verfügbaren Softwaretool Primer3 (University of Massachusetts Medical School, USA) durchgeführt. Die Primer wurden intronübergreifend entworfen und mit NetPrimer (University of Massachusetts Medical School, USA) und der Ensemble-Datenbank (www.ensembl.org) auf Fehlprimierungen, Haarnadeln und Dimere überprüft. Die Primer wurden von Eurofins Genomics Germany GmbH (Ebersberg, Deutschland) gekauft.

Die Genexpression wurde mit einem Echtzeit-PCR-Cycler Stratagene MX3005P (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) gemessen. Die Expressionsniveaus des Zielgens CYP3A4 wurden auf das geometrische Mittel der Referenzgene ACTB und GAPDH normalisiert, die sich während der gesamten Behandlung als stabil exprimiert erwiesen. Es wurde RNA aus drei unabhängigen biologischen Replikaten verwendet. Die relative Genexpression wurde mit der ΔΔCT-Methode berechnet. Es wurden drei unabhängige biologische Replikate durchgeführt, Ausreißer wurden mithilfe des Grubb-Tests identifiziert und von der Analyse ausgeschlossen.

Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism 7 oder GraphPad Prism 8 (Graphpad Software, LaJolla, CA, USA) durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) oder (SD) angezeigt. Für Verhaltens- und neurochemische Tierstudien wurden Stichprobengrößen ausgewählt, um eine Effektgröße von Cohen d > 0,5 mit α = 5 % und einer Trennschärfe von 0,8 zu erhalten. Die ausreichende Größe für Tierversuche wurde durch frühere Erfahrungen mit diesen Testparadigmen und daraus abgeleiteten Mittelwerten und Varianzen bestimmt. Dies floss in eine G-Power-Analyse für die Hauptauslesung jedes Paradigmas ein. Die Datenverteilung wurde mit dem Omnibus-Normalitätstest von D'Agostino Pearson überprüft. Wenn die Experimente aus zwei Datensätzen bestanden, wurden der ungepaarte Student-T-Test oder der Mann-Whitney-Test verwendet. Zur Berücksichtigung zweier unterschiedlicher Parameter wurde eine Zwei-Wege-ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Sidak verwendet. p ≤ 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Diese Arbeit ist dem viel zu früh verstorbenen Prof. Dr. Christian Harteneck gewidmet. Er war über viele Jahre hinweg ein inspirierender Kollege und Mitarbeiter, der auch diese Studie initiiert hat und den wir sehr vermissen. Wir danken Daniel Thon, Joscha Berger, Anja Koellner, Bea Rosskopp, Doreen Stern und Benedikt Quinger für die hervorragende technische Unterstützung. Na+-Hyperforin wurde großzügigerweise von Dr. Willmar Schwabe GmbH, Karlsruhe, Deutschland, zur Verfügung gestellt. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Deutschen Exzellenzstrategie – EXC 2051 – Projekt-ID 390713860 und Forschungsstipendien 270949263/ GRK 2162, AL 294/10-2, MU2789/7-2, MU 2789 gefördert /8-2, NU 53/12-2 und EraNet (HypZiTrp-Konsortium). Weitere Unterstützung leisteten die Carl-Zeiss-Stiftung, das vom Land Hessen geförderte Zentrum für Biomolekulare Magnetische Resonanz (BMRZ) an der Goethe-Universität Frankfurt und der vom Land Hessen geförderte LOEWE-Forschungsschwerpunkt DynaMem im Rahmen des Hessische Initiative für wissenschaftliche und wirtschaftliche Exzellenz (LOEWE) (zur UAH).

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Die folgenden Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Yamina El Hamdaoui, Fang Zheng.

Pharmakologie und Toxikologie, Institut für Pharmazeutische und Biomedizinische Wissenschaften, Johannes-Gutenberg-Universität Mainz (JGU), Mainz, Deutschland

Yamina El Hamdaoui, Nicholas Fritz, Lian Ye, Kevin Schwickert, Tanja Schirmeister und Kristina Friedland

Institute of Physiology and Pathophysiology, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), Erlangen, Germany

Fang Zheng & Christian Alzheimer

Institut für Organische Chemie und Makromolekulare Chemie, Fakultät für Chemie und Geowissenschaften, Friedrich-Schiller-Universität Jena, Jena, Deutschland

Mai Anh Tran & Ute A. Hellmich

Biochemie, Fachbereich Chemie, Johannes-Gutenberg-Universität Mainz, Mainz, Deutschland

Mai Anh Tran & Ute A. Hellmich

Abteilung Lebensmittelsicherheit, Bundesinstitut für Risikobewertung, Max-Dohrn-Str. 8-10, 10589, Berlin, Deutschland

Albert Bräuning & Dajana Lichtenstein

Exzellenzcluster „Balance of the Microverse“, Friedrich-Schiller-Universität Jena, Jena, Deutschland

Ute A. Hellmich

Zentrum für Biomolekulare Magnetresonanz, Goethe-Universität, Frankfurt, Deutschland

Ute A. Hellmich

Department of Chemistry and Pharmacy, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), Erlangen, Germany

Dorothee Weikert & Markus Heinrich

Klinik für Psychiatrie und Psychotherapie, Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz, Mainz, Deutschland

Giulia Treccani

Institut für Anatomie, Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz, Mainz, Deutschland

Giulia Treccani

Klinik für Anästhesiologie, Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz, Langenbeckstr. 1 (Gebäude 505), 55131, Mainz, Deutschland

Michael K. E. Schäfer

Abteilung für Pharmakobiologie, Medizinische Hochschule der Jagiellonen-Universität, Krakau, Polen

Gabriel Nowak

Abteilung für Pharmakologie, Experimentelle Therapie und Toxikologie, Eberhard-Karls-Universität Tübingen, Tübingen, Deutschland

Bernd Nürnberg

Department of Psychiatry and Psychotherapy, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), Erlangen, Germany

Christian P. Müller

Zentrum für Arzneimittelforschung, Universiti Sains Malaysia, 11800, Minden, Penang, Malaysia

Christian P. Müller

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KF, CA und CPM initiierten die Studie, konzipierten Experimente, überwachten die Forschung und verfassten das Manuskript. AB, DL, MKES, GN, BN, UAH und MH betreuten die Forschung. YE, LY, MAT, NF, GT, KS, TS, UAH und DW führten die chemischen, kalziumbildgebenden, elektrophysiologischen und biochemischen Studien durch. FZ und CA führten elektrophysiologische Studien an Hippocampusschnitten durch. CPM führte Verhaltensstudien durch. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse und kommentierten das Manuskript.

Korrespondenz mit Christian P. Müller oder Kristina Friedland.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

El Hamdaoui, Y., Zheng, F., Fritz, N. et al. Die Analyse der Wirkung von Hyperforin (Johanniskraut) am TRPC6-Kanal führt zur Entwicklung einer neuen Klasse von Antidepressiva. Mol Psychiatry 27, 5070–5085 (2022). https://doi.org/10.1038/s41380-022-01804-3

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Eingegangen: 25. November 2021

Überarbeitet: 02. September 2022

Angenommen: 14. September 2022

Veröffentlicht: 12. Oktober 2022

Ausgabedatum: Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41380-022-01804-3

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